樺褐孔菌中羊毛脂烷型三萜系列化合物的探討

麥勤勤，陳寅生，程麗紅，邵麗麗，吳花粉，孫明麗，武小紅

（河南大學(xué) 藥學(xué)院，河南 開封 475004）

樺褐孔菌（Inonotus obliquus）為多孔菌科的藥用真菌，分布于北半球45°～50°的地區(qū)。在我國(guó)的黑龍江、吉林兩省資源較為豐富，民間用于治療一些惡性腫瘤［1］。藥理實(shí)驗(yàn)［2－4］表明，樺褐孔菌能抑制HTC和ZHC肝癌細(xì)胞、瓦克癌肉瘤W256細(xì)胞、人MCF－7乳腺癌細(xì)胞、白血病P388細(xì)胞等多種癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，同時(shí)樺褐孔菌還具有抗病毒、抗炎及保肝等廣泛生物活性。藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究［5］發(fā)現(xiàn)，其主要有效成分為四環(huán)三萜類化合物，并有報(bào)道［6］對(duì)其中三萜進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的研究。

樺褐孔菌中羊毛脂烷型三萜類化合物大多數(shù)具有同一結(jié)構(gòu)的母核，即羊毛甾母核，相同的母核決定了它們具有許多的相同之處，而不同的取代基又使它們呈現(xiàn)出不同的性質(zhì)。我們的實(shí)驗(yàn)對(duì)樺褐孔菌中的羊毛脂烷型三萜系列化合物進(jìn)行了分離制備，并總結(jié)了其色譜行為、理化性質(zhì)、波譜數(shù)據(jù)等諸方面的一些規(guī)律。

1 儀器與試劑

AVANCE 400M型核磁共振儀（1H－NMR：300 MHz，13C－NMR：75 MHz，德國(guó)Bruker公司）；Esquire LC質(zhì)譜儀（德國(guó)Bruker公司）；XT6顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀（北京市科技電光儀器廠）；Agilent 1260型HPLC儀（美國(guó)Agilent公司）；半制備HPLC 色譜柱為Sinochrom ODS－BP （10 mm ×250 mm，10μm），（大連依利特分析儀器廠）；色譜甲醇（天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司）；Sephadex LH－20（Pharmacia公司）；Rp－18柱層析材料、Rp－18高效薄層預(yù)制板（Merck公司）；柱色譜用硅膠300～400目、薄層層析用硅膠GF254（青島海洋化工廠）；實(shí)驗(yàn)所用其他化學(xué)試劑均為分析純。

2 提取及分離

取樺褐孔菌干燥子實(shí)體粉末1000g，用體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇回流提取3次，每次1h，合并3次提取液，減壓回收溶劑后得乙醇提取物56g。用水將乙醇提取物均勻分散后，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，萃取用溶劑與水層體積比均為1∶1，各萃取4次，分別得到石油醚萃取物2.3g、乙酸乙酯萃取物26.8g、正丁醇萃取物17.0g和水層殘留物8.7g。取乙酸乙酯萃取物10g，進(jìn)行硅膠柱層析，用石油醚－乙酸乙酯（100∶0→0∶100）梯度洗脫，得到化合物1（37mg）和7個(gè)餾分Fr.1～Fr.7。將其中Fr.1餾分進(jìn)行硅膠柱層析，用石油醚－乙酸乙酯（10∶1→3∶1）梯度洗脫，得到化合物2（134mg）和5個(gè)餾分Fr.1－1～Fr.1－5。將其中Fr.1－2餾分進(jìn)行ODS開放柱層析，用甲醇－水（85%→100%）梯度洗脫，得到化合物3（56 mg）。將Fr.3餾分進(jìn)行硅膠柱層析，用氯仿－丙酮（30∶1→8∶1）梯度洗脫，得到5個(gè)餾分Fr.3－1～Fr.3－5，繼而將Fr.3－4進(jìn)行半制備HPLC，甲醇－水（82∶18）洗脫，在保留時(shí)間41.9min和46.5min處分別得到化合物4（23mg）和化合物5（16mg）。將Fr.4餾分進(jìn)行硅膠柱層析，用氯仿－甲醇（15∶1→8∶1）梯度洗脫，得到化合物6（106mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

3.1 化合物1

白色針晶（MeOH），熔點(diǎn)137.2～137.8℃。1H－NMR（CDCl3）：在高場(chǎng)區(qū)可見δ0.70（3H，s），0.82（3H，s），0.89（3H，s），0.99（3H，s），1.01（3H，s）5個(gè)角甲基的尖峰，這是四環(huán)三萜類化合物的典型特征；0.93（3H，d，J＝6.4Hz）為21－CH3峰，被20－ 位質(zhì)子偶合而裂分為雙峰，1.62（3H，s）和1.70（3H，s）為26－CH3和27－CH3兩個(gè)烯丙位的甲基峰。另外可見3.26（1H，dd，J＝4.8，11.6Hz，H－3），5.11（1H，t，J＝1.2，6.4Hz）則是24位雙鍵上的質(zhì)子信 號(hào)。13C－NMR（CDCl3）：δ79.007為C－3 信 號(hào)，134.38、134.38、130.97、125.25存在4個(gè)烯碳信號(hào)，其13C－NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［7］報(bào)道的羊毛甾醇對(duì)照一致。故鑒定化合物1為羊毛甾醇。

3.2 化合物2

白色針晶（MeOH），熔點(diǎn)182.1～182.9℃。1HNMR（CDCl3）：在高場(chǎng)區(qū)可見δ0.69（3H，s），0.71（3H，s），0.84（3H，s），0.95（3H，s），0.96（3H，s）5個(gè)角甲基的尖峰；0.91（3H，d，J＝6.6Hz）為21－CH3峰，1.62（3H，brs）和1.71（3H，brs）為26－CH3和27－CH3兩個(gè)烯丙位的甲基峰，因發(fā)生烯丙偶合而使峰展寬。另外可見3.19（1H，dd，J＝4.6，6.8Hz，H－3），3.63（1H，m，H－21），5.16（1H，t，J＝6.8，7.0 Hz，H－24）。13C－NMR（CDCl3）：δ78.83為C－3信號(hào)，73.44為側(cè)鏈上與－OH相連的C－21信號(hào)，134.87、134.51、134.11、121.36存在4個(gè)烯碳信號(hào)，其13C－NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［8］報(bào)道的inotodiol對(duì)照一致。故鑒定化合物2為inotodiol。

3.3 化合物3

白色針晶（MeOH），熔點(diǎn)145～146℃。1H－NMR（CDCl3）：在高場(chǎng)區(qū)可見δ0.69（3H，s），0.81（3H，s），0.91（3H，s），0.97（3H，s），1.00（3H，s）5個(gè)角甲基的尖峰；1.57（3H，s）和1.68（3H，s）為26－CH3和27－CH3兩個(gè)烯丙位的甲基峰。5.06（1H，t，J＝7.1Hz）是24位雙鍵上的質(zhì)子信號(hào)，9.47（1H，d，J＝5.7Hz）則是20位上的質(zhì)子信號(hào)。13C－NMR（CDCl3）：δ78.96為C－3信號(hào)，134.72、133.93、132.46、123.54存在4個(gè)烯碳信號(hào)，206.29為與C－20相連的－CHO 上的碳信號(hào)，其13C－NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［9］報(bào)道的3β－h(huán)ydroxy－lanosta－8，24－diene－21－al對(duì)照一致。故鑒定化合物3為3β－h(huán)ydroxy－lanosta－8，24－diene－21－al。

3.4 化合物4

白色針晶（MeOH），熔點(diǎn)290～292℃。1H－NMR（CDCl3／CD3OD，2∶1）：在高場(chǎng)區(qū)可見δ0.46，（3H，s），0.53（3H，s），0.61（3H，s），0.72（3H，s），0.72（3H，s）5個(gè)角甲基的尖峰；0.61（3H，d，J＝5.4Hz）為21－CH3峰，0.93（3H，s）和0.95（3H，s）為26－CH3和27－CH3的甲基峰，另外可見2.92（1H，t，J＝7.6，8.5 Hz，H－3），3.58（1H，m，H－24），4.00（1H，m，H－22）。13C－NMR（CDCl3／CD3OD，2∶1）：δ78.12為C－3信號(hào)，134.21、133.74兩個(gè)烯碳信號(hào)，其13C－NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［10］報(bào)道的inonotsuoxide A 對(duì)照一致。故鑒定化合物4為inonotsuoxide A。

3.5 化合物5

白色針晶（MeOH），熔點(diǎn)240～242℃。1H－NMR（CDCl3／CD3OD，1∶2）：在高場(chǎng)區(qū)可見δ0.73（3H，s），0.78（3H，s），0.87（3H，s），0.96（3H，s），0.98（3H，s）5個(gè)角甲基的尖峰；0.92（3H，d，J＝8.4Hz）為21－CH3峰，1.20（3H，s）和1.13（3H，s）為26－CH3和27－CH3的甲基峰。另外可見3.97（1H，m，H－24），4.00（1H，m，H－22）。13C－NMR（CDCl3／CD3OD，1∶2）：δ77.57為C－3 信號(hào)，133.35、133.96 兩個(gè)烯碳信號(hào)，其13C－NMR 數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［10］報(bào)道的inonotsuoxide B 對(duì)照一致。故鑒定化合物5為inonotsuoxide B。

3.6 化合物6

白色針晶（MeOH），熔點(diǎn)244.8～246.7℃。1HNMR（DMSO）：在高場(chǎng)區(qū)可見δ0.68（3H，s），0.69（3H，s），0.88（3H，s），0.90（3H，s），0.91（3H，s）5個(gè)角甲基的尖峰，是四環(huán)三萜類化合物的典型特征；1.53（3H，s）和1.63（3H，s）為26－CH3和27－CH3兩個(gè)烯丙位的甲基峰。5.07（1H，t，J＝7.2，7.0Hz）是24位雙鍵上的質(zhì)子信號(hào)，12.07 則是20位的質(zhì)子信號(hào)。13C－NMR（DMSO）：δ77.20為C－3 信號(hào)，134.72、133.80、131.61、124.28存在4個(gè)烯碳信號(hào)，177.52為與C－20相連的 －COOH 上的碳信號(hào)，其13C－NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11］報(bào)道的trametenolic acid對(duì)照一致。故鑒定化合物6為trametenolic acid。

4 化合物結(jié)構(gòu)及性質(zhì)分析

4.1 光譜性質(zhì)

化合物1～6母核（見圖1）相同，只是17－ 側(cè)鏈結(jié)構(gòu)不同。由于分子中均不存在共軛系統(tǒng)，故側(cè)鏈上發(fā)生取代基變化時(shí)，均通過(guò)誘導(dǎo)效應(yīng)影響其相鄰的2～3個(gè)碳的化學(xué)位移。如化合物2與化合物1 比較，發(fā)生22－OH 取代后，17、20、21、23、24、25－ 位化學(xué)位移均發(fā)生相應(yīng)變化（見表1），其他化合物亦然。每一個(gè)有機(jī)化合物分子內(nèi)部都是一個(gè)有機(jī)的整體，任何位置發(fā)生取代基的變化，都會(huì)使整個(gè)分子中的電子云密度發(fā)生變化，只是變化顯著者才有明顯的化學(xué)位移的變化。由表1可以看出，雖然化合物1～6的結(jié)構(gòu)母核完全相同，但1～17位碳化學(xué)位移卻不盡相同，因?yàn)榛衔?～6結(jié)構(gòu)中取代基不盡相同，整體分子中的電子云密度也不相同，故表現(xiàn)為相同結(jié)構(gòu)母核上的碳化學(xué)位移略有差異?；衔?和5互為構(gòu)型異構(gòu)體，它們除了在22、25、26、27－ 位碳處表現(xiàn)出較小的差異之外，其他位置均一致。故實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行了HNMR、CNMR、HSQC、HMBC、DEPT、NOESY 等全面的核磁共振譜測(cè)定，以準(zhǔn)確歸屬其C和H。

4.2 色譜行為

在硅膠色譜（正相色譜）中，化合物的極性越大，越易被固定相吸附，Rf越小，而基團(tuán)的極性大小順序?yàn)轸然救┗玖u基，故表2中化合物1～6的Rf值依次減小，化合物4和5由于極性相近而難以分離。

4.3 顏色反應(yīng)

由表2可以看出，化合物1～6顯色后所呈現(xiàn)的顏色均為紅色系，這也是三萜區(qū)別于甾體類化合物的顯著特征之一。由于此類顏色反應(yīng)過(guò)程主要是使羥基脫水，增加雙鍵結(jié)構(gòu)，再經(jīng)雙鍵移位、雙分子縮合等反應(yīng)生成共軛雙烯系統(tǒng)，又在酸作用下形成陽(yáng)碳離子而呈色，故化合物1～6中羥基較多者形成的共軛鏈就長(zhǎng)，呈色也就越深，如化合物4和5。同理，結(jié)構(gòu)中原有的不飽和鍵越多，呈色也越深，如化合物3和6，其中，化合物6的顏色最深，推測(cè)是因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)中含有的強(qiáng)極性基團(tuán)羧基，對(duì)pH的影響更敏感，故在硫酸作用下更易呈色。

4.4 熔點(diǎn)

由于在碳原子數(shù)目相同的情況下，分子中的極性基團(tuán)越多，則分子間作用力越大，熔點(diǎn)也越高，反之亦然。表2中化合物1的熔點(diǎn)最低，因?yàn)樗挥幸粋€(gè)羥基，而其他化合物的羥基數(shù)目多于1。其次，由于羥基中的活潑氫能與另一分子中的電負(fù)性原子O 形成氫鍵，而使熔點(diǎn)升高，故表2中化合物2的熔點(diǎn)高于化合物3，因?yàn)榛衔?中少了一個(gè)羥基，而其醛基中雖有電負(fù)性原子O，但缺乏活潑氫，故形成氫鍵的能力降低。此外，分子的立體結(jié)構(gòu)即分子的形狀會(huì)影響其在固體晶格中排列的緊密程度，進(jìn)而影響其熔點(diǎn)的高低，故表2中化合物4和5雖然所含極性基團(tuán)的類型及數(shù)目均相同，但是由于它們的立體結(jié)構(gòu)不同（為構(gòu)型異構(gòu)體），故熔點(diǎn)有差別。

圖1 化合物1～6的結(jié)構(gòu)母核

表1 化合物1～6的13C－NMR數(shù)據(jù)（100 MHz）

表2 化合物1～6的結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)

5 首次報(bào)道化合物4、5的DEPT和HSQC譜

化合物4和5在文獻(xiàn)［10］中被首次報(bào)道，并通過(guò)理化性質(zhì)及IR、UV、NMR、MS等將其鑒定為inonotsuoxide A和inonotsuoxide B。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中補(bǔ)充測(cè)定了其DEPT和HSQC 譜，通過(guò)DEPT和HSQC的結(jié)合，更準(zhǔn)確地歸屬每一個(gè)碳；此外，HSQC 協(xié)助解決了一些難以辨認(rèn)的峰的歸屬。

5.1 化合物4的峰

化合物4中24－C（δ77.04）峰大部分隱藏于CDCl3溶劑峰中，很難被發(fā)現(xiàn)。在HSQC 譜中可以看到77.04碳峰與3.58（m 峰）氫峰的相關(guān)峰，結(jié)合HMBC，并與已知化合物對(duì)照，最后確定δ77.04為24－C。12－C（δ30.44）與15－C（δ30.45）極其接近，難以分辨，在HSQC譜中觀察到其對(duì)應(yīng)于3個(gè)相關(guān)峰，結(jié)合HMBC，將其區(qū)分為2個(gè)非常相近的峰。21－CH3的雙峰中有一個(gè)峰完全隱藏于一個(gè)甲基尖峰中，不能發(fā)現(xiàn)，影響對(duì)化合物的結(jié)構(gòu)判斷。在HSQC譜中觀察到21－C（δ11.56）的相關(guān)峰與0.61和0.62氫峰對(duì)應(yīng)，而此2個(gè)氫峰為6個(gè)H，后又觀察到27－C（δ20.36）與0.61氫峰相關(guān)，再結(jié)合HMBC，并與已知化合物對(duì)照，最后確定21－CH3的雙峰有一個(gè)峰完全隱藏于27－CH3的單峰里。

5.2 化合物5的峰

化合物5中17－C（δ47.18）完全隱藏于CD3OD溶劑峰中，不能發(fā)現(xiàn)，會(huì)讓我們少計(jì)算一個(gè)C。但在HSQC譜中，觀察到δ47.18碳峰與δ1.42氫峰的相關(guān)峰，且在DEPT中能看到向下的δ47.18 碳峰，故判斷CD3OD 溶劑峰中隱藏了一個(gè)δ47.18 碳峰。2－C與16－C的信號(hào)重疊（δ26.38），也可能在HSQC中發(fā)現(xiàn)其對(duì)應(yīng)于不同H 峰而得到辨認(rèn)。

我們的實(shí)驗(yàn)共分離得到了6個(gè)四環(huán)三萜類化合物，并在實(shí)踐基礎(chǔ)上對(duì)其理化性質(zhì)、色譜行為和光譜性質(zhì)進(jìn)行了分析和總結(jié)。實(shí)驗(yàn)所分離的化合物為具有羊毛甾母核的同系物，為研究其生物活性成分并探討其構(gòu)效關(guān)系，奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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