回流法提取欒樹果皮中總黃酮的正交實驗研究

袁 琦，蒲曉輝，詹慕歐洋，李 哲，竟香艷，陳毛芬，周云豐，崔麗麗

（河南大學 藥學院，河南 開封 475004）

欒樹屬（Koereuteria）是無患子科落葉喬木。中國產(chǎn)有三個種，一個變種，分別為欒樹（K.henryi）、臺灣欒樹（K.paniculata）、復羽葉欒樹（K.bipinnata），變種為全緣葉欒樹（K.bipinnata var.integrifoliola）。我們主要研究回流提取方法對欒樹黃酮提取的最佳條件，為更好地利用欒樹資源提供依據(jù)［1－7］。

1 材料和儀器

1.1 材料

欒樹果殼于2012年3 月采自河南大學金明校區(qū)，自然風干，粉碎，裝袋備用。

1.2 儀器與藥品

紫外可見分光光度計UV－1600（北京瑞麗有限公司）；SHB－III循環(huán)水式真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；蘆丁標準品（中國藥品生物制品檢定所）；乙醇，硝酸鋁，亞硝酸鈉，氫氧化鈉，三氯化鋁均為分析純。

2 實驗方法

2.1 對照品溶液的配制

稱取蘆丁對照品0.01051g，用體積分數(shù)70%乙醇定容于50mL容量瓶中，配制成為0.2102g／L蘆丁乙醇溶液，作為對照品溶液。

2.2 欒樹黃酮類化合物的提取

分別準確稱取已粉碎的欒樹果皮10.0g，置磨口錐形瓶中，加入一定量不同濃度的乙醇為提取劑。在不同溫度、時間、料液比等條件下回流提取，確定正交實驗提取因素的數(shù)值。在此基礎上，設計正交法進一步確定提取的最佳條件。

2.3 供試品溶液的制備以及含量測定

欒樹果皮提取液過濾后的濾液，用相應濃度的乙醇定容于500mL容量瓶。吸取1mL置10mL容量瓶中，加50g／L NaNO2溶液0.3mL，振蕩搖勻，放置6min 后，加100g／L Al（NO3）3溶液0.3mL，振蕩搖勻，放置6min 后，再加40g／L NaOH 溶液4mL，振蕩搖勻，用體積分數(shù)為30%乙醇定容至刻度，振蕩搖勻，放置1.5h 后，于510nm 測量吸光度［8－9］。

2.4 標準曲線的制備

精密稱取0.01051g蘆丁，用體積分數(shù)為70%乙醇溶解后，定容于50 mL 容量瓶中，得0.2102g／L 蘆丁的標準溶液。精密吸取蘆丁對照液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL 分別置10mL 容量瓶中，按照“2.3”項下制備方法制備溶液，放置1.5h后，采用紫外分光光度法，在510nm 處測定吸光度。以對照品濃度（g／L）為橫坐標，吸光度為縱坐標，求得回歸方程：Y＝0.1159 X－0.00914（r＝0.9997），線性范圍（1.051～7.357）×10－2g／L。

2.5 精密度實驗

精密吸取蘆丁標準品溶液5mL 置10mL 容量瓶中，加入體積分數(shù)為30%乙醇定容。從中吸取3mL 置10mL 容量瓶中，按照“2.3”項下配制溶液后，測其吸光度，重復測定5次，測定結果的RSD為0.19%，說明采用該方法測量黃酮含量時儀器誤差較小。

2.6 重復性實驗

分別精密稱取欒樹果皮10.0g，稱取5 份，按“2.2”項下制備待測液，從中吸取1mL，按“2.3”項下配制溶液，在510nm 處測吸光度，重復測量3次，結果的RSD為0.665%，說明方法的重復性較好。

3 結果與分析

3.1 提取條件的確定

3.1.1 提取劑濃度的選擇 黃酮類化合物無論是游離的黃酮苷元還是黃酮苷都易溶于甲醇、乙醇、丙酮，根據(jù)溶劑的市場價格以及毒性，采用乙醇進行提取。在提取溫度80℃、時間2h的條件下，采用不同濃度的乙醇溶劑進行提取。按“2.3”項下方法測定提取液的吸光度，其結果見表1。

由表1可以看出，乙醇濃度在體積分數(shù)為50%以下時，提取率隨著濃度的增大而增大，當乙醇的濃度在體積分數(shù)為50%時，效果最好。但是，隨著濃度增加，提取率反而降低，主要是因為乙醇濃度不同，極性也不同。隨著乙醇濃度的升高，一些脂溶性物質的溶出增加，影響了黃酮類物質的浸出。而體積分數(shù)為50%的乙醇極性與黃酮類物質的極性相似，所以提取率最高。

3.1.2 提取時間的選擇 在體積分數(shù)為50%乙醇、提取溫度80℃、料液比1∶15的條件下，改變提取時間，進行提取。按“2.3”項下方法測定提取液的吸光度，結果見表2。

表1 乙醇濃度實驗結果數(shù)據(jù)統(tǒng)計

表2 回流提取時間數(shù)據(jù)統(tǒng)計

由表2 可知，120 min前，黃酮類物質還未充分溶出，提取率隨提取時間的延長而增加，但120 min后變化不大。因為這時欒樹果皮內的黃酮類物質溶出已達到平衡，延長時間只能降低效率，因此，提取時間以120min為宜。

3.1.3 料液比選擇 在其他情況相同條件下，不同料液比對提取效果有一定的影響。體積分數(shù)為50%乙醇、提取溫度80℃、提取時間2h、改變料液比，提取黃酮，結果見表3。

由表3可知，隨著料液比的減小，提取率增加。但當料液比小于1∶25以后，隨料液比的減小，提取率改變不大。從提取效果、減少溶劑用量和降低濃縮負荷等方面綜合考慮，選用1∶25的料液比較合適。

3.2 正交實驗設計

在以上單因素實驗的基礎上，確定每個因素的3個水平（見表4），因此，選用L9（33）正交表進行實驗［10－11］，以欒樹果皮總黃酮的提取率為考察指標。結果見表5、表6。

3.3 最佳工藝驗證實驗

由表7可知，測定的結果相比較于正交實驗表中的最佳組合（3.223%）低0.186%，但是從節(jié)約溶劑、時間上來看，時間120 min，料液比1∶30 是比較合適的。

表3 固液比實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計

表4 因素水平設計

表5 L9（33）正交實驗表

表6 方差分析表（%）

表7 最佳工藝的驗證實驗（%）

3.4 實驗結論

比較表6中R的大小，可知RB最大，故因素B對實驗結果影響最大，其次是A和C。比較各個因素不同水平的綜合平均值，可知最優(yōu)條件是A3B3C1，RA、RC比較小，因此因素A、C 對結果影響不大。考慮到成本問題，可以選擇體積分數(shù)為40%的乙醇進行提取，回流時間120 min。因此最佳方案為A2B3C3，即體積分數(shù)為40%乙醇、時間120min、料液比1∶30。

［1］楊小鳳，付宏征，雷海民，等.欒樹的化學成分［J］.藥學學報，1999，34（6）：457－462.

［2］雷海民，李強，畢葳，等.欒樹－新皂苷類化學成分的研究［J］.藥學學報，2007，42（2）：171－173.

［3］馬廣恩，申雅維，魯學照，等.栗樹抗菌有效成分的研究［J］.中草藥，1998，29（2）：84－85.

［4］丁圣彥，馮貴香，李黎.河南大學校園植物區(qū)系初步分析［J］.河南大學學報：自然科學版，2002，32（3）：51－54.

［5］丁利君，吳振輝，蔡創(chuàng)海，等.菊花中黃酮類物質提取方法的研究［J］.研究與探討，2002，23（2）：20－22.

［6］龔葉南.分光光度法測定蜂花粉中的總黃酮［J］.河南大學學報：醫(yī)學版，2009，28（2）：121－124.

［7］趙排風.軟蒺藜中總黃酮的含量測定及其提取工藝的優(yōu)化［J］.河南大學學報：醫(yī)學版，2009，28（2）：115－117.

［8］李勉，劉廣河，王雁，等.分光光度法測定開封培育菊花中總黃酮含量［J］.河南大 學學報：醫(yī)學版，2011，30（3）：174－176.

［9］馮海燕，李向軍，胡瑞省，等.超聲法提取萹蓄總黃酮的正交實驗研究［J］.河北科技大學學報，2011，12（6）：611－614.

［10］袁敏，劉道芳.正交實驗優(yōu)選滁菊總黃酮的提取工藝［J］.安徽醫(yī)藥，2006，10（8）：569－570.

［11］李榮，李小平，于生蘭，等.超聲法提取蜘蛛香中總黃酮的正交試驗研究［J］.安徽農業(yè)科學，2008，36（25）：10933－10944.