家蠅取食粗纖維后β－葡萄糖苷酶活性與基因表達(dá)量的變化

張 姝，胡 蓉，吳建偉，國(guó) 果，付 萍

(貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院人體寄生蟲(chóng)學(xué)教研室，貴陽(yáng) 550004)

β－葡萄糖苷酶(β－Glucosidase，EC，3.2.1.21)是纖維素酶重要組成部分，能催化水解芳香基或烴基與糖基原子團(tuán)之間的糖苷鍵生成葡萄糖，可以消除纖維二糖對(duì)纖維素酶的負(fù)反饋?zhàn)饔?，在農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品的降解、利用過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用(Anish et al.，2010;James et al.，2010)。關(guān)于昆蟲(chóng)利用自身β－葡萄糖苷酶降解環(huán)境中纖維素以獲得生存所需能量的研究，國(guó)內(nèi)外已有大量的報(bào)道。研究對(duì)象多以等翅目的白蟻(Nathan et al.，2011;曾文慧等，2012;Tokuda et al.，2012;劉瑞嫻等，2012)、鞘翅目的天牛和象鼻蟲(chóng)(殷幼平等，2000;Yapi et al.，2004;Wei et al.，2006;索風(fēng)梅等，2007)、鱗翅目的草地貪衣蛾(Marana et al.，2004)等為主。但對(duì)于分布廣泛，繁殖力超強(qiáng)，雜食類的家蠅Musca domestica卻未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。家蠅是生態(tài)系統(tǒng)中的分解者，在一定條件下，蠅蛆能夠食用高粱秸稈、稻草秸稈等農(nóng)副產(chǎn)品下腳料為自身提供能量。本研究以家蠅為研究對(duì)象，用粗纖維含量不同飼料進(jìn)行喂養(yǎng)，觀察家蠅不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的β－葡萄糖苷酶mRNA 表達(dá)水平和酶活性變化，探討食物中粗纖維含量對(duì)β－葡萄糖苷酶的影響。為揭示家蠅對(duì)自然界纖維素的生物轉(zhuǎn)化作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)昆蟲(chóng)

家蠅由貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院人體寄生蟲(chóng)學(xué)教研室保存。養(yǎng)蠅房恒溫25℃，光周期12L∶12D，將家蠅分為3組，對(duì)照組以麥麩喂養(yǎng)，粗纖維含量為30%，實(shí)驗(yàn)組1 用等量的高粱秸稈代替麥麩，粗纖維含量為40%，實(shí)驗(yàn)組2 等量稻草秸稈替代麥麩，粗纖維含量為50%。

1.1.2 主要試劑

水楊苷(Sigma)，非干擾型蛋白濃度檢測(cè)試劑盒(上海生工生物工程有限公司)，3，5－二硝基水楊酸(DNSA，Genview)，總RNA 提取試劑盒Trizol(Invitrogen)，Prime Script?One Step RT－PCR Kit、DNA maker、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ、pMDTM18－T(TaKaRa)。

1.1.3 主要儀器

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀(ABI7300)，凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-rad)，CT15RE 高速冷凍離心機(jī)(HITACHI)，752N 紫外分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，μ-Quant 酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek)。

1.2 方法

1.2.1 飼料殘?jiān)写掷w維含量測(cè)定

按照中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.10－2003 方法，檢測(cè)對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2三種飼料殘?jiān)写掷w維含量，同時(shí)對(duì)比飼養(yǎng)后家蠅3齡幼蟲(chóng)個(gè)體體重、體長(zhǎng)以及幼蟲(chóng)主要成分。家蠅幼蟲(chóng)中粗脂肪、粗蛋白、粗纖維、水分、灰分和碳水化合物的含量檢測(cè)委托貴州師范大學(xué)分析測(cè)試中心(計(jì)量認(rèn)證許可證:2009240425Z)依據(jù)中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T5009.3;.4;.5;.6;.10－2003 進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 家蠅樣品的采集

在對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2 中，按照文獻(xiàn)方法(張姝等，2013)，分別在家蠅不同發(fā)育階段(卵、1齡幼蟲(chóng)、2齡幼蟲(chóng)、3齡幼蟲(chóng)、蛹、成蟲(chóng))取樣，待用。

1.2.3 家蠅樣品總RNA 提取

將家蠅不同樣品采用Trizol 法提取樣品的總RNA，用酶標(biāo)儀對(duì)提取的RNA 進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算OD260nm/OD280nm比值和RNA 濃度。總RNA 用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 的完整性。采用DL2000 DNA maker 作為指示。

1.2.4 反轉(zhuǎn)錄cDNA

按照TaKaRa 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，反應(yīng)體系為:1 μg 總RNA，2μL 5×gDNA Eraser Buffer，1μL gDNA Eraser，用RNase Free ddH2O 定容至10μL，42℃2 min 后，加入4μL 5×Prime Script Buffer 2(for Real Time)，1μL Prime Script RT Enzyme Mix，1μL RT Primer Mix，4μL RNase Free ddH2O，37℃15 min，85℃5 s，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 RT－PCR

引物參照GenBank 上已發(fā)表的序列，采用primer 5 設(shè)計(jì)引物(跨內(nèi)含子)，引物序列見(jiàn)表1。引物委托上海生工公司合成。50μL反應(yīng)體系為:2μL Prime Script 1 step Enzyme Mix，25μL 2×1 step Buffer，1μL目的基因的上、下游引物，2μL Template RNA，19μL RNase Free ddH2O，ddH2O代替RNA 模板作為陰性對(duì)照。反應(yīng)條件:50℃30 min;94℃2 min;94℃30sec，58℃30sec，72℃1 min，30個(gè)循環(huán)，終止延伸。擴(kuò)增結(jié)束后，將5μL PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)和鑒定，用100bp DNA maker 作為指示。并用DNA凝膠回收試劑盒回收純化后。連接到pMDTM18－T，然后轉(zhuǎn)化E.coli DH5α 感受態(tài)細(xì)胞。進(jìn)行藍(lán)斑篩選，挑取陽(yáng)性克隆接種于LB 液體培養(yǎng)基，過(guò)夜培養(yǎng)后用質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒DNA，將質(zhì)粒送上海生工測(cè)序。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

25μL PCR反應(yīng)體系:目的基因的上下游引物各1μL，cDNA 模板2μL，SYBR Premix EX TaqTMⅡ(2X)12.5μL，RNase Free ddH2O 8μL，ROX Reference Dye(50×)0.5μL。反應(yīng)條件為:95℃30 s，95℃5 s，60℃30sec，40個(gè)循環(huán)。每一個(gè)樣品3個(gè)技術(shù)重復(fù)，每組做3個(gè)生物重復(fù)。每次PCR反應(yīng)均設(shè)置陰性對(duì)照(ddH2O代替cDNA 模板)。采用比較2－△△CT法，對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行相對(duì)定量分析。

表1 PCR 的引物Table 1 The primers of PCR

1.2.7 DNSA 法檢測(cè)β－葡萄糖苷酶活性

1.2.7.1 粗酶液的制備

按0.15 g 樣品加入1mL 0.1 M 醋酸－醋酸鈉緩沖液(pH=5.6)，冰浴研磨，在12 000 rpm，4℃，離心10 min，取上清液即為纖維素酶的粗酶液，置于－80℃冰箱中待用。

1.2.7.2 粗酶液蛋白定量

采用BCA 蛋白濃度測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定(Smith et al.，1985)。取10μL 家蠅粗酶液和6種不同濃度的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液加入2mL 的BCA 工作液，在480 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定其吸收值，計(jì)算出粗酶液的蛋白濃度。

1.2.7.3 DNSA 法檢測(cè)家蠅β－葡萄糖苷酶酶活性

采用DNSA 法測(cè)定(Miller，1959)，在離心管中分別加入1% 水楊苷0.3mL 后加入粗酶液0.1mL，混勻后在50℃水浴條件下反應(yīng)60 min，立即加入0.3mL DNSA 顯色劑終止反應(yīng)，在沸水浴顯色5 min，冷卻至室溫后，用0.1 M 醋酸－醋酸鈉緩沖液定容至5mL。于紫外分光光度計(jì)測(cè)OD540值，每一個(gè)樣品3個(gè)生物重復(fù)，每組3個(gè)重復(fù)。每次酶活性實(shí)驗(yàn)均設(shè)陰性對(duì)照(以緩沖液代替粗酶液)。從葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算葡萄糖含量。在pH 5.6、50℃反應(yīng)60 min 的條件下，以每分鐘產(chǎn)生1 umoL 葡萄糖所需的酶量定義為1個(gè)酶活性單位(IU)。纖維素酶活性大小用比活力(Willis et al.，2010)，即每mg 蛋白中的酶單位數(shù)量來(lái)表示。纖維素酶比活力(IU/mg)=(m×5.56)/(V×C×t)。m:產(chǎn)生的葡萄糖含量(mg);C:粗酶液蛋白濃度(mg/mL);V:反應(yīng)液中加入的粗酶液體積(mL);t:反應(yīng)時(shí)間(min)。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS11.5 軟件對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較用q 檢驗(yàn)，P＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料殘?jiān)写掷w維含量測(cè)定

飼料殘?jiān)写掷w維測(cè)定結(jié)果顯示，對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2 粗纖維含量為12.93±0.85%和16.4±0.41%，17.43±0.28%。對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2 的粗纖維降解效率分別為29.569±0.02%，39.59±0.009 %，49.65±0.41%。

2.2 家蠅幼蟲(chóng)的基本情況

由表2 可見(jiàn)，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組飼養(yǎng)的家蠅3齡幼蟲(chóng)平均體重分別為26.7±1.2 mg、25.0±0.6 mg和26.3±0.8 mg，平均體長(zhǎng)分別為11.7±0.7 mm、11.5±0.6 mm和12.1±0.7 mm，3 組間幼蟲(chóng)平均體重和體長(zhǎng)兩兩比較無(wú)顯著差異(P＞0.05)。3 組家蠅3齡幼蟲(chóng)主要成分檢測(cè)情況見(jiàn)表2，實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2 的家蠅幼蟲(chóng)所含的粗蛋白、粗脂肪和粗纖維含量都接近或大于麥麩飼養(yǎng)的家蠅幼蟲(chóng)。

表2 家蠅3齡幼蟲(chóng)主要成分比例Table 2 The main component ratio of the 3rd instar larvae from Musca domestica

2.3 RT－PCR 產(chǎn)物

將5 μLPCR 產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果表明，各模版擴(kuò)增的內(nèi)參基因GAPDH片段亮度相近，在209 bp 出現(xiàn)特異性條帶，與理論值一致，測(cè)序得到的核苷酸序列，與目標(biāo)序列一致。陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增條帶出現(xiàn)。3 組各生長(zhǎng)發(fā)育階段的家蠅β－葡萄糖苷酶基因在188 bp 處均出現(xiàn)了特異條帶(圖1)，大小與理論值一致，各條帶亮度存在差異。條帶亮度明暗順序?yàn)?卵＜1齡幼蟲(chóng)＜2齡幼蟲(chóng)＜齡幼蟲(chóng)＜蛹＜雌蠅≤雄蠅。陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增條帶出現(xiàn)。

2.4 家蠅β－葡萄糖苷酶基因mRNA 表達(dá)水平

以GAPDH 基因作為內(nèi)參，采用2－ΔΔCT法對(duì)不同組家蠅β－葡萄糖苷酶基因在家蠅各生長(zhǎng)發(fā)育階段的表達(dá)差異進(jìn)行分析(圖7)。在家蠅的6個(gè)生長(zhǎng)階段中家蠅β－葡萄糖苷酶基因均有表達(dá)，表達(dá)量呈逐步增強(qiáng)趨勢(shì)(P＜0.05)，其中對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2 在成蟲(chóng)期表達(dá)水平最高，較卵期分別上調(diào)了約19倍，22倍，25倍。在不同粗纖維含量3個(gè)組中，家蠅β－葡萄糖苷酶基因表達(dá)量?jī)蓛杀容^有顯著差異(P＜0.05)，且實(shí)驗(yàn)組2＞實(shí)驗(yàn)組1＞對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2 在不同生長(zhǎng)時(shí)期mRNA 表達(dá)水平較對(duì)照組分別提高了1.7～2.4倍，3.1～5.0倍。

2.5 β－葡萄糖苷酶酶活性的變化

2.5.1 粗酶液蛋白樣品的濃度測(cè)定

根據(jù)蛋白定量試劑盒說(shuō)明書(shū)，讀取不同濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品BSA 吸光度值，得到各待測(cè)粗酶液的蛋白濃度(表3)。

2.5.2 β－葡萄糖苷酶活性檢測(cè)

通過(guò)DNSA 法檢測(cè)到3個(gè)組在家蠅不同生長(zhǎng)階段均具有降解水楊苷產(chǎn)生葡萄糖的能力，酶活性高低的順序均為1齡幼蟲(chóng)期＞2齡幼蟲(chóng)＞3齡幼蟲(chóng)＞蛹期＞卵期＞成蟲(chóng)期。β－葡萄糖苷酶活性見(jiàn)圖10。如圖所示，實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2 在個(gè)體發(fā)育的不同階段β－葡萄糖苷酶活力較對(duì)照組都有提高趨勢(shì)，其中實(shí)驗(yàn)組2 的β－葡萄糖苷酶活力最高，酶活性水平較對(duì)照組提高了1.19～2.25倍。實(shí)驗(yàn)組1 的酶活性水平較對(duì)照組提高了1.04～1.37倍。

3 結(jié)論與討論

表3 粗酶液蛋白濃度(mg/mL)Tab 3 The protein content of crude enzyme solution

圖3 家蠅個(gè)體發(fā)育不同階段β－葡萄糖苷酶活性Fig.3 BG activity from Musca domestica in different development stage

我國(guó)有豐富的秸稈資源，年產(chǎn)量可達(dá)7 億多噸，居世界之首(梁榕旺和徐淑莉，2011)。這類物質(zhì)多處于植物成熟后階段，粗纖維含量很高，在31%至55%之間，受其細(xì)胞壁成分木質(zhì)化的限制，因而秸稈在直接利用上受到了限制(Tawfik and Salem，2012;劉強(qiáng)，2010)。因此利用昆蟲(chóng)對(duì)農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品進(jìn)行資源化處理已經(jīng)成為當(dāng)今可持續(xù)發(fā)展的一個(gè)重要思路(張文慶等，2008)。采用農(nóng)作物副產(chǎn)物秸稈養(yǎng)殖昆蟲(chóng)，首先是變廢為寶，將垃圾變成動(dòng)物蛋白飼料，以促進(jìn)其它經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育，其次是改善農(nóng)業(yè)環(huán)境，把對(duì)人和環(huán)境的危害，降低到最低甚至為零。如水虻科的黑水虻，擬步甲科的黃粉蟲(chóng)都已被確定為一種重要的飼用資源昆蟲(chóng)，在動(dòng)物蛋白飼料生產(chǎn)、轉(zhuǎn)化農(nóng)業(yè)廢棄物方面得到應(yīng)用和推廣(柴志強(qiáng)等，2012;黃詳財(cái)，2008)。家蠅為最常見(jiàn)的昆蟲(chóng)之一，也具有強(qiáng)大的生態(tài)轉(zhuǎn)化的作用，可將生活垃圾、麥麩、谷糠、發(fā)酵的農(nóng)作物秸稈等快速轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)，被國(guó)際上列為新型蛋白資源昆蟲(chóng)之首(Moon et al.，2001;Yadav and Garg，2011;Zhang et al.，2012)。

β－葡萄糖苷酶又稱β－D－葡萄糖苷水解酶，屬于纖維素酶類，其作為纖維素酶系中關(guān)鍵的限速酶，是調(diào)控昆蟲(chóng)降解纖維素能力的重要因素。目前對(duì)β－葡萄糖苷酶研究多集中在對(duì)酶活性和體外的克隆表達(dá)的研究(Zhang et al.，2012.;Tokuda et al.，2012;Uchima et al.，2011;Ferreira et al.，2001)，尚未見(jiàn)對(duì)昆蟲(chóng)在不同發(fā)育階段、不同生理狀態(tài)下β－葡萄糖苷酶基因表達(dá)水平和酶活性的變化趨勢(shì)報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)借助實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)，分析不同生長(zhǎng)發(fā)育階段、不同食物環(huán)境下家蠅β－葡萄糖苷酶表達(dá)特點(diǎn)和變化趨勢(shì)，揭示家蠅在不同生理狀態(tài)下對(duì)食物中纖維素的利用情況，為降解纖維素的調(diào)控因素提供了一些實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本研究以不同粗纖維含量的飼料喂養(yǎng)家蠅，結(jié)果顯示粗纖維含量的變化對(duì)家蠅的生長(zhǎng)發(fā)育無(wú)影響，家蠅身體狀況和品質(zhì)與常規(guī)麥麩飼料喂養(yǎng)無(wú)差異(P＞0.05)。在誘導(dǎo)后和正常生長(zhǎng)條件下，均有β－葡萄糖苷酶在家蠅體內(nèi)廣泛存在，其隨著飼料中粗纖維含量增加表達(dá)水平也隨之增加。在粗纖維含量為40%，家蠅降解粗纖維效率提高到39.59±0.009 %，家蠅β－葡萄糖苷酶基因表達(dá)較對(duì)照組提高了1.7～2.4倍;在粗纖維增加到50%，家蠅降解粗纖維效率提高到49.65±0.41%，家蠅β－葡萄糖苷酶表達(dá)增加較對(duì)照組提高了3.1～5.0倍。采用DNSA 法對(duì)家蠅β－葡萄糖苷酶活性的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，3個(gè)組在不同生長(zhǎng)發(fā)育階段都具有β－葡萄糖苷酶活性，β－葡萄糖苷酶活性大小的順序與家蠅β－葡萄糖苷酶基因mRNA的表達(dá)水平是一致的。因此推測(cè)家蠅在復(fù)雜生存環(huán)境條件中，是通過(guò)提高自身β－葡萄糖苷酶表達(dá)得以補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)和能量來(lái)源，以維持機(jī)體的正常生長(zhǎng)和發(fā)育。這與黃詳財(cái)?shù)膱?bào)道相似(黃詳財(cái)，2008)。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)β－葡萄糖苷酶活性的變化沒(méi)有其mRNA 的變化顯著，推測(cè)是由于基因的表達(dá)包含轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)層次，它們?cè)诎l(fā)生的時(shí)間、位點(diǎn)存在著時(shí)空差異，而轉(zhuǎn)錄后又有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的降解、翻譯以及翻譯后加工、修飾等好幾個(gè)層面，比基因轉(zhuǎn)錄更加復(fù)雜，因此轉(zhuǎn)錄水平與蛋白表達(dá)水平并不完全一致。

家蠅個(gè)體發(fā)育不同階段β－葡萄糖苷酶基因表達(dá)及其活性檢測(cè)結(jié)果提示發(fā)育過(guò)程中β－葡萄糖苷酶基因表達(dá)可能與家蠅維持正常生理功能有關(guān)。β－葡萄糖苷酶基因在家蠅卵期缺乏轉(zhuǎn)錄活性，考慮其表達(dá)產(chǎn)物是母源性轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，所檢測(cè)到的可能是母體的遺留，故呈低水平表達(dá)。幼蟲(chóng)期是家蠅迅速生長(zhǎng)的時(shí)期，生長(zhǎng)代謝較為旺盛，需要更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)提供其生長(zhǎng)發(fā)育，因此β－葡萄糖苷酶作為降解纖維素、提供能量最為重要的效應(yīng)分子，其表達(dá)的水平也呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，蛹期盡管是相對(duì)靜止的蟲(chóng)態(tài)，但為了適應(yīng)破蛹后復(fù)雜環(huán)境，仍然延續(xù)了幼蟲(chóng)期β－葡萄糖苷酶活性的增長(zhǎng)。β－葡萄糖苷酶在成蟲(chóng)期達(dá)到最大轉(zhuǎn)錄活性，可能由于家蠅的不斷生長(zhǎng)發(fā)育，其降解纖維素系統(tǒng)也在逐漸完善，另一方面這個(gè)時(shí)期也是家蠅活動(dòng)范圍最大的時(shí)期，它們的新陳代謝以及生長(zhǎng)發(fā)育都受到周圍環(huán)境的直接影響，需要盡可能的利用環(huán)境中的纖維素以提供必須的營(yíng)養(yǎng)。這與研究人員報(bào)道(黃詳財(cái)，2008)，不同齡期的黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)體內(nèi)的纖維素酶活性隨著齡期的延長(zhǎng)逐步提高相一致。由此可見(jiàn)，家蠅β－葡萄糖苷酶活性的高低與其個(gè)體發(fā)育有著密切的關(guān)系。

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