正交試驗優(yōu)選杜仲炮制工藝

羅躍龍，嚴(yán)瑞娟，，張水寒，蔡 萍，肖 娟，萬 丹

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙410208；2.湖南省中醫(yī)藥研究院中藥新藥研究與開發(fā)重點實驗室，湖南 長沙410013）

杜仲為杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoides Oliv.的干燥樹皮，有補肝腎、強筋骨、安胎之功效，用于治療肝腎不足、腰膝酸痛、胎動不安等癥[1]。明·陳嘉謨《本草蒙筌》提出“入鹽走腎臟仍仗軟堅”，故臨床上杜仲多以鹽炙品入藥，以增強其補腎健腰、強筋骨之功。傳統(tǒng)的炮制方法為鹽炙，標(biāo)準(zhǔn)以斷絲為宜，程度難以掌控，往往“太過”或“不及”，且勞動強度大，后提出烘法炮制杜仲[2]。但以上兩種方法的具體的操作工藝參數(shù)均說法不一，造成杜仲炮制品質(zhì)量難以保證，而飲片質(zhì)量是發(fā)揮臨床療效的關(guān)鍵因素，作者未見有杜仲炮制工藝研究將切制規(guī)格橫絲、縱絲、塊結(jié)合溫度、時間進行考察的記載，因此本文采用正交試驗法，首次以切制規(guī)格（橫絲、縱絲、塊）、溫度、時間為考察因素，探索鹽炙和烘制的最佳工藝，以期為提高和規(guī)范杜仲飲片的質(zhì)量提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗儀器

LC-10ATVP高效液相色譜儀（日本島津，配備SPD-M10AVP光電二極管陣列檢測器，CLASS-VP色譜工作站）；AE240型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 （上海精密實驗設(shè)備有限公司）；美的SK2103電磁爐；格蘭仕G8023YSL-V1型微波爐（佛山市順德區(qū)格蘭仕微波爐電器有限公司）；KQ3200型超聲波清洗器（江蘇昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑

松脂醇二葡萄糖苷對照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號MUST-12021001，純度＞98%）；甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純。

1.3 試藥

杜仲皮于2012年6月采自貴州省遵義市楓香鎮(zhèn)，經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所謝昭明研究員鑒定為杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoides Oliv.的樹皮，發(fā)汗備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 杜仲炮制工藝的設(shè)計

2.1.1 鹽炙杜仲 通過預(yù)實驗及參考文獻[3-4]，選擇切制規(guī)格（A）、鹽炙溫度（B）、鹽炙時間（C）作為炮制工藝的考察和外觀質(zhì)量因素，以松脂醇二葡萄糖苷含量及醇溶性浸出物量作為評價指標(biāo)，以綜合評分的方法，采用L9（34）表進行正交試驗。具體炮制方法：取杜仲皮，刮去殘留粗皮，洗凈，分別切制成0.5 cm橫絲、0.5 cm縱絲和2 cm×2 cm的塊，干燥。稱取9份，每份100 g，加食鹽水（每100 kg藥材用10 L 20%食鹽水）浸潤，待鹽水被吸盡后，置于鐵鍋中于電磁爐上進行鹽炙，按表1因素水平安排制備炮制樣品，平行試驗3次。

2.1.2 烘制杜仲 通過預(yù)實驗及參考相關(guān)文獻[3-4]，選擇切制規(guī)格（A）、烘制溫度（B）、烘制時間（C）作為炮制工藝的考察和外觀質(zhì)量因素，以松脂醇二葡萄糖苷含量及醇溶性浸出物量作為評價指標(biāo)，以綜合評分的方法，采用L9（34）表進行正交試驗。具體炮制方法：同“2.1.1”方法凈制、切制、加鹽水浸潤后，取9份，每份100 g，分別平鋪于瓷托盤上，放入電熱鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)，按表2因素水平安排制備炮制樣品，平行試驗3次。

表1 鹽炙杜仲因素水平表

表2 烘制杜仲因素水平表

2.1.3 數(shù)據(jù)處理 為客觀地反映杜仲炮制工藝中各個因素對成品質(zhì)量的影響，本試驗以傳統(tǒng)外觀質(zhì)量、醇溶性浸出物量及與杜仲功能主治相關(guān)的功效成分松脂醇二葡萄糖苷含量作為評價指標(biāo)。傳統(tǒng)外觀質(zhì)量評分，色澤方面：樣品表面黑褐色為5分；表面焦黑為4分；表面淺棕色為3分，再隨顏色變淺依次逐減。斷絲程度：將樣品沿膠絲生長方向拉長0.1 cm斷絲者為5分；拉長0.2 cm斷絲者為4分；拉長0.3 cm斷絲者為3分；依次逐減。以綜合質(zhì)量評分法進行評價，因有效成分松脂醇二葡萄糖苷含量占據(jù)重要地位，故其加權(quán)系數(shù)為0.7，醇溶性浸出物量加權(quán)系數(shù)為0.2，傳統(tǒng)外觀質(zhì)量加權(quán)系數(shù)為0.1。綜合質(zhì)量評分＝70×(松脂醇二葡萄糖苷實際量/松脂醇二葡萄糖苷最高量)＋20×(醇溶性浸出物實際量/醇溶性浸出物最高量)＋10×(傳統(tǒng)外觀質(zhì)量實際評分/傳統(tǒng)外觀質(zhì)量最高分)。

2.2 醇溶性浸出物的測定[1]

取炮制杜仲樣品適量，剪成碎片，揉成絮狀，取2 g，精密稱定，置250 mL錐形瓶中，精密加75%乙醇100 mL作溶劑，按《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄ⅩA醇溶性浸出物測定法（熱浸法）測定，以干燥品計算樣品中醇溶性浸出物量。

2.3 松脂醇二葡萄糖苷含量的測定[1]

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Promosil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為甲醇-水(25∶75)，檢測波長277 nm，體積流量1.0 mL/min，柱溫25℃，進樣量20μL。

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取松脂醇二葡萄糖苷對照品適量，加甲醇制成濃度為0.49 mg/mL的溶液，搖勻即得。

2.3.3 供試品溶液的制備 取炮制杜仲樣品適量，剪成碎片，揉成絮狀，取約5 g，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理60 min[5]，放冷。再稱定質(zhì)量，用50%乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液2、4、8、12、16、20μL注入高效液相色譜儀，測定。對照品進樣量（Y）對其相應(yīng)色譜峰峰面積（X）的線性回歸方程為：

表明松脂醇二葡萄糖苷在0.98～9.8μg范圍內(nèi)峰面積與進樣量的線性關(guān)系良好。

2.3.4 樣品測定 分別精密吸取各炮制杜仲樣品的供試品溶液20μL、對照品溶液20μL，分別注入高效液相色譜儀中，按照“2.3.1”項下色譜條件進行測定，外標(biāo)一點法計算樣品（以干燥品計）中松脂醇二葡萄糖苷的含量。

2.4 試驗結(jié)果及方差分析

2.4.1 試驗結(jié)果 鹽炙和烘制杜仲工藝的正交試驗結(jié)果見表3～4。

表3 鹽炙杜仲工藝正交試驗結(jié)果 （±s，n=3）

表3 鹽炙杜仲工藝正交試驗結(jié)果 （±s，n=3）

列號 A B C 空白 松脂醇二葡萄糖苷(m g/g) 醇浸出量(%) 外觀質(zhì)量(分) 綜合評分1 1 1 1 1 0.59±0.0 1 14.84±0.41 6 33.79 2 1 2 2 2 0.59±0.0 1 14.81±0.34 9 36.75 3 1 3 3 3 0.88±0.0 1 16.44±0.38 8 42.81 4 2 1 2 3 1.11±0.02 16.35±0.35 5 43.79 5 2 2 3 1 1.94±0.0 4 17.15±0.37 6 60.47 6 2 3 1 2 1.85±0.0 3 15.98±0.42 9 60.50 7 3 1 3 2 2.71±0.0 4 16.85±0.52 7 74.80 8 3 2 1 3 2.43±0.0 4 16.33±0.42 9 71.22 9 3 3 2 1 1.76±0.0 4 15.90±0.52 8 57.81 K 1 113.35 152.37 165.51 152.07 K 2 164.76 168.44 138.35 172.05 K 3 203.82 161.12 178.07 157.81 R 90.47 16.07 39.72 19.98

表4 烘制杜仲工藝正交試驗結(jié)果 （±s，n=3）

表4 烘制杜仲工藝正交試驗結(jié)果 （±s，n=3）

列號 A B C 空白 松脂醇二葡萄糖苷(m g/g) 醇浸出量(%) 外觀質(zhì)量分(分) 綜合評分1 1 1 1 1 1.19±0.0 2 15.21±0.38 9 47.88 2 1 2 2 2 0.75±0.0 1 14.22±0.30 9 38.91 3 1 3 3 3 0.52±0.0 1 12.72±0.35 9 33.07 4 2 1 2 3 1.79±0.0 3 16.67±0.46 10 61.24 5 2 2 3 1 1.51±0.0 3 15.53±0.42 7 51.94 6 2 3 1 2 1.21±0.0 2 11.18±0.26 9 43.54 7 3 1 3 2 3.94±0.0 8 16.33±0.47 9 98.04 8 3 2 1 3 0.44±0.0 1 12.17±0.25 8 30.01 9 3 3 2 1 0.07±0.0 1 12.76±0.32 8 24.12 K 1 119.86 207.17 121.42 123.94 K 2 156.72 120.86 124.27 180.49 K 3 152.18 100.73 183.05 124.32 R 36.86 106.44 61.63 56.55

2.4.2 方差分析 鹽炙杜仲及烘制杜仲的方差分析結(jié)果分別見表5～6。

表5 鹽炙杜仲工藝方差分析表

表6 烘制杜仲工藝方差分析表

鹽炙杜仲工藝以綜合質(zhì)量為評價指標(biāo)時，由極差R可知影響鹽炙杜仲質(zhì)量的主次因素依次為A＞C＞B，方差分析結(jié)果顯示，A因素有顯著性影響，而B和C因素?zé)o明顯影響；最佳鹽炙工藝方案為A3B2C3，即切制成2 cm×2 cm的塊，鹽炙溫度為180℃，鹽炙時間為10 min。

烘制杜仲工藝以綜合質(zhì)量為評價指標(biāo)時，由極差R可知影響烘制杜仲質(zhì)量的主次因素依次為B＞C＞A，方差分析結(jié)果顯示，方差分析結(jié)果顯示，A、B和C因素均無明顯影響；最佳烘制工藝方案為A2B1C3，即切制成0.5 cm的縱絲，烘制溫度為120℃，烘制時間為0.5 h。

2.5 驗證試驗

本實驗優(yōu)選出的鹽炙與烘制工藝最佳組合均不在正交表試驗方案中，故需進行驗證試驗。鹽炙：將杜仲切制成2 cm×2 cm的塊，稱取100 g置于鐵鍋中，于電磁爐上180℃鹽炙10 min，取出，晾涼即得。平行試驗3次。烘制：將杜仲切制成0.5 cm的縱絲，稱取100 g平鋪于瓷托盤上，放入120℃的電熱鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)，烘制0.5 h。平行試驗3次。驗證結(jié)果見表7。并用SPSS 16.0軟件對兩種工藝結(jié)果進行t檢驗。

表7 驗證試驗結(jié)果 （±s）

表7 驗證試驗結(jié)果 （±s）

試驗組 松脂醇二葡萄糖苷(mg/g) 醇浸出量(%)鹽炙 2.78±0.04 17.13±0.05烘制 4.01±0.04 16.48±0.05

驗證試驗表明，二指標(biāo)數(shù)據(jù)均大于正交表9個組合中任何一組，故優(yōu)選的工藝參數(shù)合理可行，能制備出質(zhì)量穩(wěn)定的杜仲飲片。用SPSS 16.0軟件輸出的t檢驗結(jié)果中，t統(tǒng)計量的相伴概率P均為0，小于顯著性水平0.05，證明兩種工藝的松脂醇二葡萄糖苷含量和醇浸出量平均值存在顯著性差異?？紤]到松脂醇二葡萄糖苷為杜仲的主要有效成分，故認(rèn)為烘制工藝為較佳選擇。

3 討論

前人對杜仲炮制品質(zhì)量評價方面，有的采用斷絲率或單采用醇浸出物為指標(biāo)，評價指標(biāo)單一。松脂醇二葡萄苷為杜仲的主要的降壓成分[6]，以其為主要評價指標(biāo)，再結(jié)合《中華人民共和國藥典》2010版一部中規(guī)定的醇浸出物量，更能合理地反映出炮制品的質(zhì)量。另外，在炮制工藝的考察因素上，前人還常涉及加鹽量的考察，但通過預(yù)實驗及文獻研究，加鹽量對炮制質(zhì)量影響不大，反而是不同的切制規(guī)格成為炮制質(zhì)量優(yōu)劣的關(guān)鍵因素，故本文將切制規(guī)格列為考察對象之一。

本研究同時優(yōu)選了鹽炙和烘制兩種方法的操作工藝，其中烘制工藝中于120℃烘制0.5 h時縱絲和塊的綜合評分均較高，鹽炙最佳工藝的切制規(guī)格亦為塊，這與歷來研究得出的杜仲以切制成橫絲為最佳的結(jié)論有所不同，可見切制規(guī)格或許也因“法”制宜。通過比較兩種炮制方法的最佳工藝，烘制品較鹽炙品綜合質(zhì)量高，且烘法有節(jié)能、回收率高、勞動強度低等優(yōu)點，便于規(guī)模化。后續(xù)研究將進一步從藥理學(xué)試驗、臨床研究等方面論證烘制杜仲的工藝效果，企業(yè)可考慮以此法替代傳統(tǒng)鹽炙法而達到低成本規(guī)范化生產(chǎn)，并提高杜仲飲片的質(zhì)量從而提高效益。

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