HPLC測定不同生長期和采收期太空蓮葉中荷葉堿的含量

唐伯辰，梁華正，劉成佐，江旦林，2，廖曉峰

（1.東華理工大學(xué)化學(xué)生物與材料科學(xué)學(xué)院，江西 撫州344000；2.臨川之信生物科技有限公司，江西 撫州344000）

荷葉為睡蓮科植物蓮的干燥葉，傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)認(rèn)為荷葉有清暑化濕、升發(fā)清陽、涼血止血等功效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，荷葉堿是荷葉的主要藥效成分之一，荷葉堿具有刺激胰島素分泌[1]、抗病毒[2]、降脂減肥[3]等作用，有關(guān)荷葉堿的分離提取及高效液相色譜分析方法的文獻(xiàn)報道較多[4-8]。撫州市廣昌縣種植白蓮有1 300多年的歷史，享有“白蓮之鄉(xiāng)”的美譽(yù)，從1994年至今，廣昌白蓮先后兩次進(jìn)行太空育種，選育后的太空蓮品種大大提高了蓮子產(chǎn)量，但對于太空蓮葉中荷葉堿含量的研究鮮見報道[9]。本文采用高效液相色譜法對不同生長期的太空蓮葉中荷葉堿的含量進(jìn)行了測定，為充分利用荷葉資源提供參考。

1 儀器與試劑

1.1 主要儀器

LC-20AT/SPD-10A高效液相色譜儀(日本島津)；N2000色譜數(shù)據(jù)工作站(浙江大學(xué)智達(dá)信息工程有限公司)；電子天平（梅特勒托利多儀器有限公司）；酸度計（上海雷磁）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）。

1.2 材料與試劑

荷葉（采自江西省撫州市廣昌縣）經(jīng)東華理工大學(xué)生物系饒軍教授鑒定為睡蓮科植物蓮Nelumbo nucifera Gaertn.的干燥葉；乙腈（色譜純，西隴化工股份有限公司）；荷葉堿對照品（中國藥品生物制品檢定所）；水為二次蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的配制 取荷葉堿對照品適量，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別配制成0.8 mg/mL的溶液備用。

2.1.2 供試品溶液的制備 將新鮮荷葉用水洗凈，70℃烘干，粉碎，過40目篩，取約1.0 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，每次加pH 2.0的90%甲醇溶液50 mL，回流提取2 h，提取兩次，濾過于100 mL容量瓶中，用pH 2.0的90%甲醇溶液洗滌、稀釋至刻度，搖勻，備用。再精密吸取25 mL，置50 mL容量瓶中，用pH 2.0的90%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，備用。

2.2 色譜條件

色譜柱為Hypersil BDS C18柱 (4.6 mm×250 mm，5.0μm)；流動相為乙腈-水-三乙胺-乙酸（27∶70.6∶1.6∶0.78）；流速為1.0 mL/min；檢測波長為270 nm；進(jìn)樣量為20μL；柱溫為室溫。HPLC圖見圖1。

圖1 荷葉堿對照品(a)和供試品溶液(b)色譜圖

2.3 線性關(guān)系考察

分別取0.2 mg/mL荷葉堿對照品溶液0.5、1、2、4、6、8、10 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，精密量取各溶液20μL注入色譜儀，記錄荷葉堿峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：

結(jié)果表明荷葉堿對照品溶液在0.01～0.2 mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 精密度試驗

精密吸取荷葉堿對照品溶液20μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，荷葉堿峰面積的RSD為0.9%，表明精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗

精密吸取荷葉供試品溶液20μL，分別在0、2、4、6、8 h進(jìn)樣，測定荷葉堿的峰面積，結(jié)果RSD為1.2%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗

取同一采集地點和時間太空蓮葉樣品5份，按“2.1.2”項方法分別制備供試品溶液，測定峰面積并計算含量為0.455%，RSD為1.4%。

2.7 回收率試驗

取荷葉粉末1 g，精密稱定，分高、中、低3個濃度，分別加入荷葉堿對照品溶液0.5、1、1.5 mL，按上述供試品溶液的制備方法及色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果平均回收率為98.7%，RSD=1.5%。結(jié)果見表1。

表1 荷葉堿加樣回收率測定結(jié)果表

2.8 不同采收期太空蓮葉中荷葉堿含量

按藥典要求，荷葉采收期一般為夏秋兩季，因此選取6月至10月為樣品采集期。由于采集期內(nèi)的大部分時間段，荷塘中都有多種不同生長狀態(tài)的荷葉，荷葉生長大致可分為5個階段，初生嫩葉，生長期嫩葉，近成熟葉，成熟葉，衰老葉[10]。因此在每個時間點均采集5個不同生長期的荷葉樣本，選取的采集時間點為6月5日、7月5日、8月5日、9月5日、10月5日，每次采集5組不同太空蓮葉，分別為：初生期嫩葉，葉子剛由葉芽展開，葉片單薄，青綠色；生長期嫩葉，葉片舒展，黃綠色，質(zhì)嫩；近成熟葉，葉子直徑已近成熟，黃綠色；成熟葉，葉片寬大，綠色，葉片厚實；衰老葉，葉子邊緣萎蔫，黃褐色[10]。依法分別測定5個采集期內(nèi)5種不同生長狀態(tài)的荷葉中荷葉堿的含量，結(jié)果見表2。

由表2可知，8月5日的初生嫩葉荷葉堿含量最高，但是由于初生嫩葉生物量太小，而成熟葉和近成熟葉生物量大，因此一般荷葉采集以成熟葉和近成熟葉為主。由表2可知，5組不同荷葉樣品，荷葉堿含量有顯著差異性，近成熟葉的荷葉堿含量普遍大于成熟葉，而8月至9月的近成熟葉荷葉堿含量相對其他時間段的近成熟葉荷葉堿含量要高，因此建議荷葉應(yīng)該在8月至9月采集近成熟葉為主。

表2 不同采集期內(nèi)不同生長狀態(tài)的太空蓮葉中荷葉堿的含量 （n=3，±s，%）

表2 不同采集期內(nèi)不同生長狀態(tài)的太空蓮葉中荷葉堿的含量 （n=3，±s，%）

注：6月與7、8、9月嫩葉比較**P＜0.01。

各期葉片初生嫩葉生長嫩葉近成熟葉成熟葉衰老葉6月5日0.235±0.003 0.305±0.005 0.356±0.007 0.201±0.004 0.106±0.006 7月5日0.331±0.004 0.372±0.005 0.391±0.008 0.322±0.005 0.125±0.007荷葉堿含量（%）8月5日0.522±0.005**0.489±0.004**0.466±0.006 0.355±0.008 0.113±0.005 9月5日0.501±0.007**0.488±0.006**0.455±0.009 0.368±0.004 0.156±0.007 10月5日未采到未采到0.436±0.008 0.388±0.007 0.185±0.006

3 討論

3.1 流動相的選擇

采用了不同比例的甲醇-水、乙腈-水為流動相，荷葉堿峰分離度小且峰型拖尾嚴(yán)重，加入0.78%的冰乙酸和1.6%的三乙胺，峰型較好，分離效果較好，可滿足對樣品的檢測要求。

3.2 樣品荷葉堿提取方法的選擇

實驗中采用了多種有機(jī)溶劑進(jìn)行提取試驗，如甲醇、乙醇、四氫呋喃、二甲亞砜、氯仿等，相對而言甲醇提取效果較好，且毒性相對較小，因此選用甲醇作為提取溶劑。同時還考察不同酸度和固液比對提取效率的影響，結(jié)果為以甲醇為提取溶劑，固液比為1∶50，回流提取2 h，提取次數(shù)為2次，pH 2.0時，荷葉堿提取率最高。

3.3 關(guān)于荷葉藥材的質(zhì)量

按藥典要求，荷葉采收期一般為夏秋兩季，作為藥材的干荷葉，其荷葉堿含量要求大于0.1%。由于受品種、氣候、水質(zhì)、土壤環(huán)境甚至炮制工藝等因素影響，荷葉質(zhì)量參差不齊，有關(guān)研究表明，以荷葉中的荷葉堿為指標(biāo)成分，采用高效液相色譜法進(jìn)行含量測定，結(jié)果在隨機(jī)抽取的24個樣品中，僅2個樣品合格，22個樣品不合格，合格率為8.3%[11]。太空蓮近成熟葉中荷葉堿含量達(dá)到0.45%以上，高于一般荷葉的荷葉堿含量[10-11]。目前在撫州市廣昌縣，太空蓮種植集約化程度相對較高，具有較好的開展中藥材GAP種植的條件，因此太空蓮葉作為荷葉藥材資源具有較好的前景。

荷葉在上世紀(jì)90年代就被列入“既是食品又是藥品”的名單，我國具有豐富的荷葉資源，在“蓮子之鄉(xiāng)”的撫州市廣昌縣，蓮農(nóng)采摘蓮子之后，荷葉都枯萎在荷塘里自然腐爛，浪費(fèi)了資源。本文通過對太空蓮葉中荷葉堿的研究，為荷葉資源的開發(fā)利用提供了參考依據(jù)。

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