Sorcin沉默表達(dá)對(duì)人卵巢癌耐藥細(xì)胞SKOV3/CDDP耐藥性的影響及機(jī)制

天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院，天津300100

Sorcin沉默表達(dá)對(duì)人卵巢癌耐藥細(xì)胞SKOV3/CDDP耐藥性的影響及機(jī)制

劉明艷 張虹

天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院，天津300100

背景與目的：腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性的產(chǎn)生是卵巢癌化療失敗的主要原因之一，Sorcin被發(fā)現(xiàn)在多種耐藥腫瘤細(xì)胞中過度表達(dá)，可作為逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性(multi-dncg resistance，MDR)的靶點(diǎn)。本研究探討Sorcin沉默表達(dá)對(duì)逆轉(zhuǎn)人卵巢癌耐藥細(xì)胞SKOV3/CDDP耐藥性的作用及機(jī)制。方法：構(gòu)建Sorcin穩(wěn)定沉默SKOV3/CDDP細(xì)胞系后，采用MTS、流式細(xì)胞術(shù)、蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)、RT-PCR及熒光報(bào)告質(zhì)粒等方法，觀察腫瘤細(xì)胞藥物敏感性、細(xì)胞內(nèi)羅丹明123含量、細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞周期的變化，MDR基因(multi-drug resistance gene，MDR1)、MDR相關(guān)蛋白(multi-drug resistance-associated protein，MRP1)、Survivin及Bcl-2 mRNA及蛋白水平表達(dá)的變化，Akt磷酸化水平及NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的變化。結(jié)果：Sh-Sorcin-1和Sh-Sorcin-2沉默Sorcin表達(dá)可提高SKOV3/CDDP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，提高腫瘤細(xì)胞凋亡率并將細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，Sh-Sorcin-1和Sh-Sorcin-2腫瘤細(xì)胞中羅丹明123含量相比未轉(zhuǎn)染對(duì)照組分別提高了1.64倍和2.46倍，MDR1、MRP1、Survivin及Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下降，MDR1 mRNA表達(dá)分別是未轉(zhuǎn)染對(duì)照組的42.3%和26.5%，MRP1 mRNA表達(dá)分別是對(duì)照組的33.2%和18.9%，Survivin mRNA表達(dá)分別是未轉(zhuǎn)染對(duì)照組的36.2%和29.6%，Bcl-2 mRNA表達(dá)分別是未轉(zhuǎn)染對(duì)照組的54.6%和46.7%，Akt磷酸化水平顯著下降，NF-κB轉(zhuǎn)錄活性分別是未轉(zhuǎn)染對(duì)照組的56.3%和38.4%。結(jié)論：抑制Sorcin表達(dá)可逆轉(zhuǎn)SKOV3/CDDP細(xì)胞MDR性，提高腫瘤細(xì)胞藥物敏感性，其機(jī)制可能與降低細(xì)胞Akt磷酸化水平、降低NF-κB活性有關(guān)。

卵巢癌；Sorcin；腫瘤耐藥

［Key words］Ovarian Cancer; Sorcin; Drug resistance

卵巢癌(ovarian cancer)是婦女常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅婦女生命健康，據(jù)2011年發(fā)表的全球腫瘤統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2008年全球發(fā)達(dá)地區(qū)卵巢癌發(fā)病率為9.4/100 000，死亡率達(dá)5.1/100 000[1]。目前卵巢癌公認(rèn)和有效的根治性手段為外科手術(shù)加鉑類化療藥物為主的聯(lián)合化療，但腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性(multi-drug resistance，MDR)的產(chǎn)生往往引起化療失敗，腫瘤復(fù)發(fā)率達(dá)40%～60%，5年生存率僅為30%[2]。Sorcin是相對(duì)分子質(zhì)量為22×103的鈣結(jié)合蛋白，在多種MDR腫瘤細(xì)胞中表達(dá)明顯增高，表明其可能在腫瘤的MDR中起著重要的作用，有可能作為逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞MDR的靶點(diǎn)[3-4]。但是Sorcin在腫瘤MDR發(fā)生中確切的作用和機(jī)制仍然很不清楚。因此我們通過慢病毒介導(dǎo)的shRNA干擾Sorcin基因表達(dá)，研究干擾Sorcin表達(dá)對(duì)卵巢癌MDR表型的逆轉(zhuǎn)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

順鉑(cisplatin，CDDP)為南京制藥廠有限公司產(chǎn)品。鼠抗人Sorcin、MDR基因MDR1、MDR相關(guān)蛋白MRP1、Survivin及Bcl-2單克隆抗體購自美國 Abcam 公司，Akt抗體及其磷酸化抗體來自Cell Signaling公司；青霉素、鏈霉素、胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基來自GIBCO公司；Sorcin shRNA慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒及對(duì)照control-shRNA、嘌呤霉素均購自上海Sigma公司；TRIzol RNA提取試劑購自Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBGREE實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒為Takara公司產(chǎn)品，Bradford 蛋白濃度測定試劑盒為碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品，ECL化學(xué)發(fā)光試劑為GE公司產(chǎn)品，雙熒光素酶報(bào)告試劑盒來自美國Promega公司，NF-κB熒光報(bào)告質(zhì)粒3xNF-κB-pGL3購自Addgene，羅丹明123購自上海Sigma公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞 SKOV3/CDDP為本實(shí)驗(yàn)室保存。細(xì)胞用含 10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和 100 U/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、飽和濕度、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)。細(xì)胞密度80%時(shí)，經(jīng)0.25%胰酶消化后吹打成單細(xì)胞懸液常規(guī)傳代。

1.3 RNA干擾及篩選

取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，于96孔板中分別接種1.5×104/孔實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后分別于實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞和陰性對(duì)照組細(xì)胞加入5 μL表達(dá)Sorcin-shRNA或control-shRNA慢病毒，轉(zhuǎn)導(dǎo)慢病毒72 h后用含嘌呤霉素(0.5 μg/mL)的培養(yǎng)基篩選2周，得到穩(wěn)定干擾的細(xì)胞株，蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測干擾效率，并用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，分為SKOV3母細(xì)胞組(Parent)、SKOV3/ CDDP未轉(zhuǎn)染對(duì)照組(Control)、SKOV3/CDDP空載體轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組(Negative)、SKOV3/CDDP Sorcin-shRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)1和2組(sh-Sorcin-1和2)。

1.4 MTS法檢測細(xì)胞增殖

取對(duì)數(shù)生長期的空白組、對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，經(jīng) 0.25%胰酶消化后吹打成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)/mL，接種于 96 孔培養(yǎng)板中，每孔 100 μL。培養(yǎng)24 h 后，棄原培養(yǎng)液，按照0.5、1、5、10、50、100 mg/L梯度稀釋的CDDP加入新培養(yǎng)液，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)平行復(fù)孔。置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)48 h，每孔加MTS溶液20 μL，繼續(xù)溫育2～4 h，用酶標(biāo)儀檢測各孔波長 490 nm 處的吸光度(A)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。記錄結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線，計(jì)算SKOV3/CDDP細(xì)胞IC50，按照公式耐藥倍數(shù)(RI)=IC50DDP/IC50parent，計(jì)算SKOV3/CDDP細(xì)胞在Sorcin干擾后耐藥性變化。

1.5 細(xì)胞周期及凋亡檢測

取對(duì)數(shù)生長期的空白組、對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，用10 mg/L CDDP作用24 h，經(jīng) 0.25%胰酶消化后吹打成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106個(gè)/mL，3 mL PBS洗滌1次，300×g離心5 min去除PBS，加入冰預(yù)冷的70%乙醇4 ℃固定2 h，300×g離心棄去固定液，3 mL PBS重懸5 min，400目的篩網(wǎng)過濾1次，300×g離心5 min，棄去PBS，用1 mL 1 mg/mL PI染液4 ℃避光染色30 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期及凋亡。

1.6 羅丹明-123蓄積實(shí)驗(yàn)

各組細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液，800 r/min離心5 min，棄去上清液，重懸于含5 mmol/L羅丹明-123的培養(yǎng)液中， 37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的溫箱中培養(yǎng)30 min，以培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，繼續(xù)用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)10 min后，用培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，然后以1 mL預(yù)冷的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。

1.7 熒光定量PCR檢測耐藥相關(guān)基因mRNA變化

按TRIzol試劑盒說明書提取實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞總RNA，瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性，紫外分光光度計(jì)測定260和280 nm光密度值，計(jì)算RNA的純度與濃度，使用1%DEPC水調(diào)節(jié)RNA至相同濃度。按照試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄、PCR反應(yīng)。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。GAPDH：上游引物： 5’-ACCACCATGGAGAAGGCTGG-3’，下游引物：5’-CTCAGTGTAGCCCAGGATGC-3’；MDR1 ：上游引物：5’-GAATCTGGAGGAAGAC ATGACC-3’，下游引物：5’-TCCAAT TTTGTCACCAATTCC-3’； MRP1：上游引物：5’-TCAGCCCTTCCTGACAAGCT-3’，下游引物： 5’-TCTCTGCTGCAGGAGGTCCG-3’；Survivin ：上游引物：5’-GCCCAGTGTTTCTT CTGCTT-3’；下游引物： 5’-CCGGACGAATGC TTTTTATG-3’；Bcl-2上游引物：5’-GTGGAGGAGCTCTTCAGGGA-3’；下游引物：5’-AGGCACCCAGGGTGATGCAA-3’。

1.8 Western blot檢測耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)變化

各組細(xì)胞用0.9%NaCl溶液清洗3次，加入適量預(yù)冷的細(xì)胞裂解液冰浴裂解30 min，移至1.5 mL EP管中，4 ℃ 13 000×g離心20 min，吸取上清液至新的EP管中，Bradford法測定蛋白濃度。取40 μg總蛋白經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠(PAGE，4%濃縮膠、10%分離膠)80 V電壓下電泳3 h后，電轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，加入相應(yīng)一抗，4 ℃溫育過夜。TBST洗膜6次后，加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1∶5 000)，室溫溫育30～45 min，TBST洗膜6次后與ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色1～2 min，X膠片曝光。

1.9 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測啟動(dòng)子活性

將1 μg NF-κB熒光報(bào)告質(zhì)粒以及0.02 μg對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，24 h后按照說明書檢測熒光素酶活性。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 Sorcin穩(wěn)定沉默表達(dá)細(xì)胞系的鑒定

使用表達(dá)Sorcin-shRNA及Control-shRNA慢病毒干擾的SKOV3/CDDP細(xì)胞，經(jīng)嘌呤霉素(0.5 μg/mL)篩選2周，得到穩(wěn)定干擾細(xì)胞株。Western blot檢測結(jié)果顯示，MDR卵巢癌細(xì)胞株SKOV3/CDDP表達(dá)Sorcin蛋白，經(jīng)shRNA干擾后，與SKOV3/CDDP未轉(zhuǎn)染對(duì)照組(Control)相比，SKOV3/CDDP空載體轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組(Negative)細(xì)胞Sorcin蛋白表達(dá)無明顯變化， Sh-Sorcin-1組和Sh-Sorcin-2組細(xì)胞Sorcin蛋白表達(dá)量明顯減少(圖1)。

2.2 Sorcin沉默增加SKOV3/CDDP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性

MTS法檢測結(jié)果顯示，SKOV3/CDDP細(xì)胞干擾Sorcin表達(dá)后，順鉑對(duì)細(xì)胞的殺傷明顯增加(P＜0.05)；并且隨著藥物濃度的增加，殺傷作用明顯增加，呈現(xiàn)劑量依賴性，SKOV3的IC50為7.26 mg/L，SKOV3/CDDP的IC50為23.66 mg/L，耐藥指數(shù)為3.26，Sh-Sorcin-1組IC50為18.54 mg/L，耐藥指數(shù)為2.56，Sh-Sorcin-2組IC50為12.33 mg/L，耐藥指數(shù)為1.70，表明干擾Sorcin后可提高卵巢癌耐藥細(xì)胞SKOV3/CDDP對(duì)順鉑的藥物敏感性(圖2)。

圖 2 Sorcin沉默對(duì)SKOV3/CDDP細(xì)胞順鉑敏感性的影響Fig.2 The effect of Sorcin silencing on cisplatin drug sensitivity of SKOV3/CDDP cells

2.3 Sorcin沉默對(duì)SKOV3/CDDP細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，采用10 mg/L順鉑作用24 h后，Control組、Sh-Sorcin-1和Sh-Sorcin-2組細(xì)胞凋亡率分別為22.3%、43.4%、56.6%，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率明顯升高，Control組、Sh-Sorcin-1和Sh-Sorcin-2組的G2/M期細(xì)胞百分率為8.73%、 21.43%、28.2%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，Sorcin沉默后Sh-Sorcin-1和Sh-Sorcin-2組細(xì)胞被阻滯在G2/M期，提示細(xì)胞耐藥性發(fā)生逆轉(zhuǎn)，而Control組與Negative細(xì)胞組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖3、4)。

2.4 Sorcin沉默對(duì)SKOV3/CDDP細(xì)胞羅丹明-123蓄積的影響

羅丹明-123的蓄積實(shí)驗(yàn)顯示，Sh-Sorcin-1和Sh-Sorcin-2組細(xì)胞中羅丹明-123含量較Control組分別提高了1.64倍和2.46倍(圖5)。由此提示，Sorcin沉默增加耐藥腫瘤細(xì)胞的藥物敏感性，與其細(xì)胞膜上的糖蛋白泵出藥物的活性有關(guān)。

2.5 Sorcin沉默對(duì)SKOV3/CDDP細(xì)胞耐藥相關(guān)基因mRNA水平的影響

以GAPDH為內(nèi)參，RT-PCR檢測結(jié)果顯示，Sh-Sorcin-1和Sh-Sorcin-2組MDR1 mRNA表達(dá)分別是Control組的42.3%和26.5%，MRP1 mRNA表達(dá)分別是Control組的33.2%和18.9%，Survivin mRNA表達(dá)分別是Control組的36.2%和29.6%，Bcl-2 mRNA表達(dá)分別是Control組的54.6%和46.7%(圖6)。

2.6 Sorcin沉默對(duì)SKOV3/CDDP細(xì)胞耐藥相關(guān)蛋白的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，與Control組相比，Sorcin沉默表達(dá)后SKOV3/CDDP細(xì)胞MDR1、MRP1和Survivin、Bcl-2表達(dá)減少，說明Sorcin沉默能下調(diào)耐藥腫瘤細(xì)胞耐藥相關(guān)蛋白MDR1、MRP蛋白和凋亡抑制蛋白的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)細(xì)胞耐藥(圖7)。

2.7 Sorcin沉默對(duì)SKOV3/CDDP細(xì)胞信號(hào)通路的影響

Sorcin沉默表達(dá)后SKOV3/CDDP細(xì)胞Akt蛋白表達(dá)變化不明顯，但磷酸化水平顯著下降，雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)結(jié)果顯示，Sh-Sorcin-1和Sh-Sorcin-2組 NF-κB啟動(dòng)子活性分別是Control組的56.3%和38.4%(圖8)，表明Sorcin沉默抑制了Akt的磷酸化以及NF-κB的活化。

圖 3 Sorcin沉默對(duì)SKOV3/CDDP細(xì)胞凋亡的影響Fig. 3 The effect of Sorcin silencing on apoptosis of SKOV3/CDDP cells

圖 4 Sorcin沉默對(duì)SKOV3/CDDP細(xì)胞周期的影響Fig. 4 The effect of Sorcin silencing on cell cycle of SKOV3/CDDP cells

圖 5 Sorcin沉默對(duì)SKOV3/CDDP細(xì)胞Rh-123蓄積的影響Fig.5 The effect of Sorcin silencing on Rh-123 content of SKOV3/CDDP cells

圖 6 Sorcin沉默對(duì)SKOV3/CDDP細(xì)胞耐藥相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響Fig. 6 The effect of Sorcin silencing on mRNA expression of drug resistance related gene of SKOV3/CDDP cells

圖 7 Sorcin沉默對(duì)SKOV3/CDDP細(xì)胞耐藥相關(guān)基因蛋白表達(dá)的影響Fig. 7 The effect of Sorcin silencing on protein expression of drug resistance related genes of SKOV3/CDDP cells

圖 8 Sorcin沉默對(duì)SKOV3/CDDP細(xì)胞信號(hào)通路的影響Fig. 8 The effect of Sorcin silencing on signal transduction pathway of SKOV3/CDDP cells

3 討 論

卵巢癌是婦女發(fā)病率較高的癌癥之一，化療是卵巢癌術(shù)后的主要治療手段，但MDR的形成往往導(dǎo)致化療效果欠佳。因此尋找MDR逆轉(zhuǎn)劑成為腫瘤研究中的一個(gè)熱點(diǎn)。

腫瘤細(xì)胞MDR的形成是一個(gè)復(fù)雜的、多因素參與的過程，其機(jī)制主要有藥物外排能力增加、藥物代謝酶活性的變化、凋亡抵抗力增加及藥物親和力改變等，分子表型主要表現(xiàn)為藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包括MDR基因MDR1編碼的P糖蛋白(p-Glycoprotein，P-gP)、MDR相關(guān)蛋白(multidrug resistance-associated protein，MRP)等表達(dá)增加，這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通過ATP提供能量，將細(xì)胞毒類藥物泵出細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而使細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)多種藥物的耐藥性。因此，逆轉(zhuǎn)MDR必須要抑制腫瘤細(xì)胞耐藥相關(guān)基因表達(dá)。

本研究發(fā)現(xiàn)，在人卵巢癌耐藥細(xì)胞SKOV3/ CDDP中Sorcin蛋白處于高表達(dá)狀態(tài)，而以慢病毒為載體的shRNA可以有效地干擾Sorcin的表達(dá)。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)和羅丹明-123蓄積實(shí)驗(yàn)表明，干擾Sorcin可有效逆轉(zhuǎn)細(xì)胞耐藥，使腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性分別提高了2.56倍和1.70倍。而RT-PCR和Western blot檢測表明，MDR1和MRP mRNA水平與蛋白質(zhì)水平均明顯降低，顯示干擾Sorcin可抑制MDR1和MRP的表達(dá)及活性，從而逆轉(zhuǎn)細(xì)胞耐藥。胃癌中的研究已表明，Sorcin與胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移、TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)等密切相關(guān)[4]，過表達(dá)Sorcin可以上調(diào)MDR基因的表達(dá)，而MDR抑制劑可以逆轉(zhuǎn)Sorcin誘導(dǎo)的MDR[5]，大腸癌中的研究也表明，Sorcin可誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞的MDR表型[6]。非小細(xì)胞肺癌中的研究表明Sorcin的表達(dá)與吉西他濱的耐藥密切相關(guān)[7]。在急性髓性白血病中，Sorcin過表達(dá)的患者臨床預(yù)后往往較差，并且與MDR1的表達(dá)正相關(guān)[8]。這與本研究的結(jié)果一致。但也有研究表明，干擾Sorcin表達(dá)可以上調(diào)MDR1 mRNA水平的表達(dá)[9]。因此，Sorcin在腫瘤MDR中的作用仍然需要進(jìn)一步深入研究。

本研究結(jié)果也表明，干擾Sorcin可使凋亡抑制基因Survivin及Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下降。已有文獻(xiàn)報(bào)道，Sorcin可以通過調(diào)節(jié)線粒體中鈣離子濃度從而抑制細(xì)胞色素C的釋放和caspase的激活，從而抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生[10]。白血病中的研究也表明，過表達(dá)Sorcin可以上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)而下調(diào)Bax蛋白的表達(dá)，表明Sorcin可能通過調(diào)節(jié)凋亡來參與MDR的形成[11]。研究表明，Sorcin可以與凋亡通路中的重要蛋白TRAP1直接作用，增加TRAP1蛋白的穩(wěn)定性，從而影響細(xì)胞的凋亡的發(fā)生[12]。因此，Sorcin在腫瘤細(xì)胞MDR中的作用可能與其凋亡抑制作用相關(guān)。

本研究通過蛋白印跡和熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，干擾Sorcin可抑制Akt蛋白的磷酸化，降低NF-κB的活性。PI3K/Akt信號(hào)通路在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用，Akt是該信號(hào)通路中的關(guān)鍵性效應(yīng)分子。近年來的研究表明PI3K/Akt信號(hào)通路在腫瘤MDR也起著重要作用[13-15]。而轉(zhuǎn)錄因子NF-κB可通過促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制分化、抑制凋亡、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移等在腫瘤形成及發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。同時(shí)，NF-κB可以結(jié)合MDR1、MRP1基因啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)，促進(jìn)MDR1的轉(zhuǎn)錄、翻譯表達(dá)，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的耐藥。對(duì)Akt磷酸化和對(duì)NF-κB活性的抑制可能是干擾Sorcin逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞MDR的內(nèi)在機(jī)制。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，Sorcin可作為逆轉(zhuǎn)卵巢癌MDR的靶位點(diǎn)，干擾Sorcin表達(dá)可降低耐藥基因MDR1和MRP表達(dá)，同時(shí)降低凋亡抑制基因表達(dá)，從而提高耐藥細(xì)胞的藥物敏感性，其機(jī)制可能與抑制PI3K/Akt信號(hào)通路、下調(diào)NF-κB活性有關(guān)。本研究將進(jìn)一步研究Sorcin對(duì)奈達(dá)鉑等鉑類抗腫瘤藥耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用，為卵巢癌的臨床治療提供依據(jù)。

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The effect and mechanism of Sorcin silencing on drug resistance of human ovarian cancer SKOV3/ CDDP cell lines

LIU Ming-yan, ZHANG Hong (Tianjin Central Hospital of Gynecology Obstetrics, Tianjin 300100, China)

LIU Ming-yan E-mail: batistuta211@163.com

Background and purpose: Multi-drug resistance is a major reason for the chemotherapy failure of human ovarian cancer. Sorcin was found overexpression in drug resistance tumors and it may be the target of multidrug resistance reversal. The present article was aimed to study the effect and mechanism of Sorcin silencing on drug resistance of human ovarian cancer SKOV3/CDDP cell lines. Methods: The stable Sorcin silencing SKOV3/CDDP cell lines were established. MTS assay, flow cytometry was used to analyze the intra-cellular Rh-123 content, cells apoptosis and cycle. Real-time, Western blot and report gene assay were used to analyze the expression changes of genes, including MDR1, MPR1, Survivin, Bcl-2, p-Akt and NF-κB. Results: Sorcin inhibition enhanced the drug sensitivity of SKOV3/CDDP cells, increased the intra-cellular Rh-123 content and cell apoptosis, and arrested cell cycle in G2/M. The protein levels of MDR1, MPR1, Survivin, Bcl-2, p-Akt were down-regulated, the mRNA levels of MDR1 of Sh-Sorcin-1 and Sh-Corcin-2 group were decreased to 42.3% and 26.5% of untransfected control, MRP1 were decreased to 33.2% and 18.9% of untransfected control, Survivin were decreased to 36.2% and 29.6% of untransfected control, Bcl-2 were decreased to 54.6% and 46.7% of untransfected control, transcriptional activity of NF-κB were decreased to 56.3% and 38.4% of untransfected control respectively inSKOV3/CDDP cell lines after Sorcin silence. Conclusion: Sorcin silencing could reverse SKOV3/CDDP drug resistance and enhance drug sensitivity, which involves the decreased phosphorylation level of Akt and transcriptional activity of NF-κB.

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.06.007

R737.31

：A

：1007-3639(2013)06-0439-08

2013-03-04

2013-06-05）

劉明艷 E-mail:batistuta211@163.com