miR-216a通過靶向調(diào)控蛋白激酶Cα抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖和侵襲

湘南病理研究所，湘南學院免疫學院級重點學科，湖南 郴州 423000

miR-216a通過靶向調(diào)控蛋白激酶Cα抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖和侵襲

趙文健 楊亮 唐偉軍

湘南病理研究所，湘南學院免疫學院級重點學科，湖南 郴州 423000

背景與目的：MicroRNAs是一類19～25 bp內(nèi)源非編碼的小分子RNA，其通過靶向抑制基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平。本研究旨在明確miR-216a是否通過靶向調(diào)控蛋白激酶Cα(PRKCA)表達而抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖和侵襲能力，從而進一步揭示miR-216a的抑瘤分子機制。方法：首先構建PRKCA 3’UTR-熒光素酶報告載體，通過雙熒光素酶報告檢測觀察miR-216a對PRKCA 3’UTR-熒光素酶活性的影響；將miR-216a mimics轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細胞U251，采用Western blot檢測PRKCA蛋白表達水平；將PRKCA siRNA轉(zhuǎn)染U251細胞，通過MTS細胞增殖活性檢測和transwell侵襲實驗觀察PRKCA下調(diào)對U251細胞增殖和侵襲的影響。結果：雙熒光素酶報告檢測顯示，miR-216a能特異性地與PRKCA mRNA的3’UTR結合，抑制其熒光素酶活性，下調(diào)41%。過表達miR-216a的U251細胞PRKCA蛋白表達水平降低。siRNA干擾PRKCA表達能抑制U251細胞的增殖和侵襲，它能部分模擬miR-216a的抑瘤功能。結論：miR-216a通過靶向PRKCA mRNA 3’UTR而抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖和侵襲。

膠質(zhì)瘤；miR-216a；蛋白激酶Cα；細胞增殖；侵襲

近年來，miRNA成為分子生物學研究熱點，人類miRNA通過調(diào)控其靶基因的表達及相關信號通路，具有類似于瘤基因或抑瘤基因的功能，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過程中發(fā)揮重要作用。研究表明，miR-216a在乳腺癌、肝癌、前列腺癌等多種腫瘤中表達下調(diào)［1-6］。miR-216a可通過靶向CD44和CDC42抑制乳腺癌的生長與侵襲［1］。但miR-216a在膠質(zhì)瘤中的表達報道較少。蛋白激酶Cα(PRKCA)與腫瘤基因的不穩(wěn)定性和腫瘤細胞的增殖、抗凋亡、侵襲、藥物抵抗有關［7-8］，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。本研究通過采用生物信息學靶基因預測、熒光素酶報告活性檢測、Western blot等分子生物學技術，證實了miR-216a可通過靶向調(diào)控PRKCA抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖和侵襲，進一步揭示了miR-216a的抑瘤分子機制。

1 材料和方法

1.1 主要材料

T4DNA連接酶、SpeⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶均為大連寶生物公司產(chǎn)品。miR-216a mimics為Ambion公司產(chǎn)品。PRKCA siRNA由Invitorgen公司合成，序列為：5’-GGGATCGAACAACAAGGAA-3’。雙熒光素酶活性檢測試劑盒購自Promega公司。PRKCA單克隆抗體和GAPDH抗體購自Epigentek公司。DMEM培養(yǎng)基為Hyclone公司產(chǎn)品。胎牛血清購自杭州四季青公司。MTS細胞增殖/毒性檢測試劑盒購自美國Promega公司。鋪有基質(zhì)膠的Transwell侵襲小室購自BD Biosciences公司。

1.2 野生型PRKCA 3’UTR-熒光素酶報告載體的構建

通過Targetscan、Pictar、miRase軟件預測出miR-216a可能與PRKCA mRNA的3’UTR片段1 319～1 325 bp結合。根據(jù)PRKCA 3’UTR序列設計末端帶SpeⅠ和HindⅢ酶切位點的特異性引物。引物序列為：F:5’-AGAACTAGTGAGTGTTGGGTGAATCTG-3’；R:5’-GTCAAGCTTCTATCACGTAAACTAGCC-3’(帶下劃線的為酶切位點)。

以健康志愿者血細胞DNA為模板(郴州市第一人民醫(yī)院體檢中心)，PCR擴增PRKCA 3’UTR部分片段(635～1 515 bp)。將PCR產(chǎn)物與pMIRREPORT luciferase報告載體分別用Spe Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切后純化，連接，轉(zhuǎn)化，鑒定。構建野生型PRKCA 3’UTR-熒光素酶載體，命名為PRKCA-Wt。突變型PRKCA 3’UTR-熒光素酶報告載體構建由Invitrogen公司合成，命名為pPRKCA-Mut。

1.3 熒光素酶活性檢測

將熒光素酶報告載體與miR-216a mimics或scramble 共轉(zhuǎn)染U251細胞(人膠質(zhì)瘤細胞系，購自于上海生化與細胞研究所)。以轉(zhuǎn)染pRL-TK作為標準內(nèi)質(zhì)控。轉(zhuǎn)染36 h后，收獲細胞。按Promega公司雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書在單光子檢測儀檢測細胞熒光素酶活性。計算相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值。

1.4 Western blot檢測

將miR-216a mimics 或scramble轉(zhuǎn)染U251細胞，48 h后提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取等量樣本，進行SDS-PAGE凝膠電泳分離，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，1% BSA封閉后，加入PRKCA抗體或GAPDH抗體，4 ℃過夜。TBST洗膜10 min，加入二抗室溫溫育1 h，TBST洗膜10 min，加入ECL發(fā)光劑、X片曝光、顯影、定影。

1.5 MTS法檢測細胞增殖活性［9］

取轉(zhuǎn)染后的U251細胞，消化后接種細胞于96孔板中，每組設6個平行復孔，放37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在未接種細胞的孔中加入DMEM培養(yǎng)基中作為調(diào)零孔。接種后24、48、72 h各檢測1次。檢測時每孔加20 μL MTS檢測試劑，37 ℃溫育2 h，用酶標儀測定570 nm波長吸光度值(A570)。實驗重復3次。

1.6 Transwell細胞侵襲實驗

先將鋪有基質(zhì)膠的Transwell板預熱至37 ℃。消化PRKCA siRNA 或miR-216a mimics轉(zhuǎn)染的U251細胞，用無血清培養(yǎng)基洗滌2次，再用無血清培養(yǎng)基重懸細胞，細胞計數(shù)，調(diào)整細胞數(shù)為1×105/mL。在Transwell下室加入800 μL含15% FCS的培養(yǎng)基。在Transwell上室加入250 μL細胞懸液，37 ℃培養(yǎng)48 h。取出Transwell，擦掉靠上室側膜的細胞，PBS洗后將Transwell用4%甲醛溶液中固定10 min，結晶紫染色，顯微鏡下觀察、照相，隨機選取5個高倍視野(×100)進行細胞計數(shù)，并計算平均值。實驗重復3次［10］。

1.7 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行處理。結果均以表示。兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 miR-216a對PRKCA mRNA的3’UTR的熒光酶活性的影響

為明確miR-216a能否結合PRKCA 3’UTR，將miR-216a mimics或scramble與pPRKCA-Wt、PRKCA-Mut共轉(zhuǎn)染到U251細胞中。以轉(zhuǎn)染pRLTK作為內(nèi)參照。雙熒光酶活性檢測結果顯示，miR-216a mimics明顯抑制野生型PRKCA-Wt報告載體的熒光素酶活性，下調(diào)41%(P＜0.05)；而miR-216a mimics對突變型PRKCA-Mut載體的熒光素酶活性無明顯抑制作用(圖1)。這些結果表明miR-216a能特異性與PRKCA mRNA的3’UTR結合。

圖 1 miR-216a抑制PRKCA mRNA的3’UTR的熒光酶活性Fig. 1 miR-216a inhibits the luciferase activity of PRKCA mRNA

2.2 miR-216a對PRKCA蛋白表達的影響

將miR-216a mimics轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤U251細胞48 h后，以轉(zhuǎn)染scramble為陰性對照，轉(zhuǎn)染PRKCA siRNA為陽性對照。通過Western blot檢測PRKCA蛋白表達水平。Western blot檢測結果顯示，轉(zhuǎn)染miR-216a組PRKCA蛋白表達較scramble組明顯降低(圖2)。該結果提示，在膠質(zhì)瘤中miR-216a能下調(diào)PRKCA蛋白的表達。

2.3 PRKCA siRNA或miR-216a對膠質(zhì)瘤細胞增殖和侵襲的影響

將miR-216a mimics轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤U251細胞，以轉(zhuǎn)染scramble為陰性對照，通過MTS法檢測細胞增殖活性。結果發(fā)現(xiàn)，過表達miR-216a的U251細胞從48 h起增殖速度明顯減慢，與scramble對照細胞相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖3)，同時Transwell細胞侵襲實驗后取出Transwell固定，結晶紫染色，顯微攝影，計數(shù)任意5個顯微視野的穿過基底膜的細胞數(shù)進行統(tǒng)計分析，過表達miR-216a的U251細胞較對照細胞侵襲能力明顯降低(P＜0.05，圖4)。同理將PRKCA siRNA轉(zhuǎn)染到U251中48 h后，結果提示干擾PRKCA能顯著抑制膠質(zhì)瘤U251細胞的增殖，與scramble對照細胞相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖3)。Transwell細胞侵襲結果顯示，干擾PRKCA的U251細胞較對照細胞侵襲能力明顯降低(P＜0.05，圖4)。這些結果表明，干擾PRKCA能抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖和侵襲，它能部分模擬miR-216a的抑瘤功能。此外，miR-216a抑制U251細胞增殖和侵襲的強度要大于PRKCA siRNA，可能與除了PRKCA這個靶點外，miR-216a還能通過調(diào)控其他的靶基因抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖和侵襲有關。

圖 2 Western blot檢測miR-216a對PRKCA蛋白表達的改變Fig. 2 miR-216a inhibits the expression of PRKCA protein detected by Western blot assay

圖 3 PRKCA siRNA或miR-216a抑制U251細胞增殖Fig. 3 PRKCA siRNA or miR-216a inhibits the proliferation of U251 cells

3 討 論

圖 4 Transwell細胞侵襲實驗檢測過表達miR-216a或干擾PRKCA表達對U251細胞侵襲的影響Fig. 4 Overexpression of miR-216a or PRKCA siRNA inhibits the invasion of U251 cells by Transwell assay (×100)

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，WHO分類系統(tǒng)將其分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ級，治愈率低，生存期短，其中膠質(zhì)母細胞瘤的5年生存率＜5%，平均生存期僅14個月［11］。因此，亟待發(fā)現(xiàn)新的治療靶點和早期診斷標志。目前研究表明，腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生不僅受基因變異的影響，也存在表觀遺傳學改變。microRNA是目前生命科學研究的熱點，在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮著重要作用［12-13］。PKC是存在于細胞漿內(nèi)由鈣活化的磷脂依賴性絲/蘇氨酸蛋白激酶家族，廣泛參與調(diào)節(jié)生命過程中的許多生物學事件，如轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，免疫介導，學習與記憶，受體脫敏，細胞生長、分化、增殖、癌變及凋亡過程［14-15］。至今已從不同種屬的器官中分離、純化出12種不同的PKC亞型。本研究證實了PRKCA是miR-216a調(diào)控的直接靶基因。并且也通過siRNA干擾實驗證實了下調(diào)PRKCA表達確實能抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖和侵襲，它能部分模擬miR-216a的抑瘤功能。結合以往PKC在腫瘤中的研究成果，說明miR-216a可通過靶向調(diào)控PRKCA表達抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖和侵襲，這進一步揭示了miR-216a的抑瘤分子機制。

綜上所述，miRNA作為瘤基因或抑瘤基因功能的發(fā)現(xiàn)，為腫瘤病因及發(fā)病機制的研究提供了新思路，也為腫瘤預防、診斷、預后判斷提供了新策略［16］。繼續(xù)深入miR-216a在膠質(zhì)瘤中的研究，闡明miR-216a參與膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的分子機制，可為膠質(zhì)瘤的防治提供理論依據(jù)和實驗基礎。

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miR-216a suppresses cell proliferation and invasion by targeting PRKCA in glioma

ZHAO Wen-jian, YANG Liang, TANG Wei-jun (Xiangnan Institute of Pathology, Xiangnan Key Discipline of Immunology, Hunan Chenzhou, 423000)

TANG Wei-jun E-mail: zwjyl_1613@163.com

Background and purpose: MicroRNAs are 19–25-nucleotide noncoding RNA molecules that regulate gene expression at the level of transcription and translation. The study aimed to confirm whether miR-216a suppresses cell proliferation and invasion by targeting PRKCA, thus to reveal molecular mechanism that miR-216a functions as a tumor suppressor in glioma. Methods: PRKCA 3’ untranslated region (UTR)-luciferase vector was constructed and dual-luciferase reporter gene assay was employed to examine the effect of miR-216a on luciferase activity. U251 cells were transfected with miR-216a mimics, and next Western blotting was performed to detect the expression of PRKCA protein. The effects of PRKCA downregulation on cell proliferation and invasion were observed after PRKCA siRNA was transfected into U251 cells. U251 cell proliferation assays were performed when cotransfected with miR-216a mimics. Results: The result demonstrated miR-216a could bind to the 3’UTR of PRKCA and inhibited the luciferase activity by 41%. PRKCA protein expressions were significantly down-regulated when miR-216a was overexpressed in U251. siRNA-mediated downregulation of PRKCA could suppress the potentials of cell proliferation and invasion. Conclusion: miR-216a suppresses cell proliferation and invasion by targeting PRKCA in glioma.

Glioma; miR-216a; PRKCA; Cell proliferation; Cell invasion

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.06.004

R739.41

：A

：1007-3639(2013)06-0420-05

2013-01-24

2013-04-25）

湘南學院重點建設學科基金資助(No: xnu125kd019)。

唐偉軍 E-mail:zwjyl_1613@163.com