新型18F-RGD二聚體的正常生物分布及U87MG荷瘤裸鼠小動物PET/CT顯像研究

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海200032

新型18F-RGD二聚體的正常生物分布及U87MG荷瘤裸鼠小動物PET/CT顯像研究

鮑曉 王明偉 徐俊彥 鄭宇佳 蔣津津 章英劍

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海200032

背景與目的：整合素αvβ3受體在促進(jìn)、維持以及調(diào)節(jié)血管生成的過程中有著至關(guān)重要的作用，高表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞及新生血管內(nèi)皮細(xì)胞。RGD多肽序列可與整合素αvβ3受體特異性結(jié)合，有助于評價腫瘤的生長狀況和侵襲性。本實驗主要研究18F標(biāo)記的RGD二聚體18F-E［c(RGDfK)2］在正常昆明小鼠體內(nèi)的生物分布和荷人神經(jīng)膠質(zhì)瘤裸鼠模型的小動物PET/CT顯像情況。方法：以硝基RGD二聚體4-NO2-3-TFMBz-E［c(RGDfK)2］為前體，使用改進(jìn)的自動化合成模塊Explora GN，一步法直接標(biāo)記合成18F-E［c(RGDfK)2］。用昆明小鼠分析18F-E［c(RGDfK)2］0.5、1、2、4 h的生物分布，計算每克組織放射性占注入量的百分比(%ID/g)。觀察荷人神經(jīng)膠質(zhì)瘤裸鼠模型1、2、4 h的小動物PET/CT顯像情況。結(jié)果：18F-E［c(RGDfK)2］的標(biāo)記率約為10%，放化純度＞98%，穩(wěn)定性可達(dá)10 h。18F-E［c(RGDfK)2］主要經(jīng)腎排泄，血液清除迅速，注射后1 h，腎、肝、小腸、肌肉和血的放射性攝取值分別為(1.02±0.16)%ID/g、(0.24±0.06)%ID/g、(0.35±0.03)%ID/g、(0.13±0.03)%ID/g和(0.11±0.03)%ID/g。注射后1 h，腫瘤對18F-E［c(RGDfK)2］的攝取達(dá)到高峰(5.2±0.56)%ID/g，T/M為5.36。阻斷顯像中，可見腫瘤組織放射性攝取明顯減低，T/M平均值為1.57。結(jié)論：18F-E［c(RGDfK)2］與整合素受體特異性結(jié)合，腫瘤攝取較高、顯像清晰，可用于整合素表達(dá)陽性腫瘤的預(yù)后判斷、血管靶向治療適應(yīng)證的選擇及療效判斷。

18F-E［c(RGDfK)2］；整合素；荷人神經(jīng)膠質(zhì)瘤裸鼠模型；小動物PET/CT

腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲及轉(zhuǎn)移依賴于血管生成［1］，當(dāng)腫瘤直徑超過2 mm時，其繼續(xù)生長就必須依靠血液供應(yīng)。整合素αvβ3受體在促進(jìn)、維持以及調(diào)節(jié)血管生成的過程中有著至關(guān)重要的作用，其高表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞(如骨肉瘤、膠質(zhì)瘤、惡性黑色素瘤、肺癌、乳腺癌等)及新生血管內(nèi)皮細(xì)胞，而在成熟血管內(nèi)皮和正常組織中不表達(dá)或低表達(dá)［2-3］。測定腫瘤組織中整合素受體的表達(dá)水平，有助于評價腫瘤的生長狀況和侵襲性。包含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)序列的多肽，可以與整合素αvβ3受體特異性結(jié)合。整合素的這一特性，使其在腫瘤預(yù)后判斷、血管靶向治療適應(yīng)證的選擇及療效判斷領(lǐng)域中，成為非常有吸引力的靶點，已有多篇文獻(xiàn)報道了放射性核素(18F、99Tcm、64Cu等)標(biāo)記的RGD多肽對整合素αvβ3受體具有良好的靶向性和顯像效果［4-7］，其中18F-Galacto-RGD和18F-fluciclatide已進(jìn)入臨床試驗階段［8-9］。本研究主要探討18F標(biāo)記的新型RGD環(huán)肽18F-E［c(RGDfK)2］在昆明小鼠體內(nèi)的生物分布和荷人神經(jīng)膠質(zhì)瘤裸鼠的小動物PET/CT顯像研究。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 細(xì)胞

U87MG人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.1.2 動物

昆明小鼠20只，雌性，4～5周齡，體質(zhì)量17～20 g；BALB/c雌性裸鼠5只，4～6周齡，體質(zhì)量20～25 g，均購于復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院實驗動物部，并在其實驗中心飼養(yǎng)。

1.1.3 主要試劑

RGD二聚體硝基前體4-NO2-3-TFMBz-E［c(RGDfK)2］(化學(xué)純度＞99%)由美國國立衛(wèi)生研究院陳小元教授惠贈。藥用乙醇為南京化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；K222(Kryptofix 222)、無水乙腈和無水碳酸鉀為美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；HPLC/光譜純乙腈為美國TEDIA公司產(chǎn)品；富［18O］氧水購自上?；ぱ芯吭?。其他化學(xué)試劑均為分析純，購自國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司。DMEM培養(yǎng)基購自HyClone公司，內(nèi)含10%胎牛血清、青霉素100 IU/mL、鏈霉素100 μg/mL；0.25%胰酶購自Gibco公司。

1.1.4 主要儀器

醫(yī)用回旋加速器(40 μA×11 MeV)、Explora GN合成模塊(配有可編寫合成控制軟件)、半制備型高效液相色譜儀(HPLC，Explora LC，配有紫外和放射性檢測器)均為SIEMENS公司產(chǎn)品；分析型HPLC(1200系列)，配有可變波長檢測器、流式γ放射性檢測器(Gabi Star購自德國Raytest公司)、Zorbax 300SB-C18分析柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)為美國Agilent公司產(chǎn)品；放射性活度計(CRC?-15PET)為美國Capintec公司產(chǎn)品。電子天平購自SARTORIUS公司BSA223S；γ放射性免疫計數(shù)儀為上海日環(huán)儀器廠SN-697型；小動物PET/CT購自SIEMENS公司，型號為Inveon。

1.218F-E［c(RGDfK)2］的制備

依據(jù)參考文獻(xiàn)［10］建立18F-E［c(RGDfK)2］的放射化學(xué)合成路線，使用參考文獻(xiàn)［11］中改進(jìn)的Explora GN模塊進(jìn)行自動化合成。具體制備過程是將干燥活化的18F離子與前體4-NO2-3-TFMBz-E［c(RGDfK)2］(0.8～1.5 mg)在無水DMSO (0.8 mL)中140 ℃加熱反應(yīng)20 min，冷卻后，經(jīng)Sep-Pak C18柱預(yù)處理、半制備HPLC純化、C18柱賦型，獲得18F-E［c(RGDfK)2］的注射用溶液，利用Radio-HPLC分析其放射化學(xué)純度。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及動物模型的建立

U87MG人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞用上述調(diào)配好的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每3～4 d于細(xì)胞對數(shù)生長期時1︰3傳代培養(yǎng)。用PBS洗滌細(xì)胞后，0.25%胰酶消化，離心(1 000 r/min，5 min，離心半徑為13.5 cm)，DMEM培養(yǎng)基吹打混勻，調(diào)整細(xì)胞濃度準(zhǔn)備接種。在每只BALB/c雌性裸鼠右腋下，皮下注射3×106～5×106個細(xì)胞(約0.2 mL)，飼養(yǎng)于IVC級動物房2～3周，每周用游標(biāo)卡尺測量腫瘤直徑，待腫瘤直徑長至0.8～1 cm時，即可用于實驗。

1.4 正常小鼠體內(nèi)生物分布

20只昆明小鼠，均從尾靜脈注射18F-E［c(RGDfK)2］ 30 μCi(1.11 MBq)。按照完全隨機(jī)法分為4組(n=5)，分別于注射后0.5、1、2、4 h脫頸處死，收集血液及相應(yīng)臟器(肝、腎、骨等)，稱其濕重并測量各臟器放射性計數(shù)，計算每克組織放射性占注入量的百分比(%ID/g)。

1.5 荷瘤裸鼠小動物PET/CT顯像

5只荷瘤裸鼠分別自尾靜脈注射18F-E［c(RGDfK)2］ 100 μCi(3.7 MBq)，于注射后1、2、4 h在異氟烷麻醉狀態(tài)下，行小動物PET/CT掃描，三維模式采集10 min靜態(tài)圖像。OSEM3D/ MAP法重建，獲得衰減校正后荷瘤裸鼠體內(nèi)18F-E［c(RGDfK)2］分布融合圖像，在腫瘤部位和對側(cè)肌肉勾畫感興趣區(qū)域(regions of interest，ROI)，測定%ID/g。

1.6 荷瘤裸鼠阻斷實驗

將18F-E［c(RGDfK)2］ 30 μCi(1.11 MBq)與300 μg F-RGDfK2混勻，經(jīng)荷瘤裸鼠尾靜脈注入(n=3)，注射后1 h在異氟烷麻醉狀態(tài)下，行小動物PET/CT掃描，采集10 min靜態(tài)圖像。

2 結(jié) 果

2.118F-E［c(RGDfK)2］的制備

基于硝基前體4-NO2-3-TFMBz-E［c(RGDfk)2］的一步直接標(biāo)記法制備18F-E［c(RGDfK)2］，反應(yīng)過程簡單，易于自動化合成。利用改進(jìn)的Explora GN模塊實現(xiàn)了18F-E［c(RGDfK)2］的自動化合成，放化產(chǎn)率為0.5%～1%，標(biāo)記率為10%，放化純度＞98%，穩(wěn)定性可達(dá)10 h(約5個半衰期)。

2.2 正常小鼠體內(nèi)生物分布

18F-E［c(RGDfK)2］在小鼠體內(nèi)吸收迅速、清除較快，以腎臟放射性攝取最高，且顯著高于其他組織器官，注射后0.5、1、2、4 h腎臟放射性攝取值分別為(1.74±0.47)%ID/g、(1.02±0.16)%ID/g、(0.74±0.23)%ID/g、(0.33±0.14)%ID/g，其在1、2、4 h較0.5 h分別下降了41.38%、57.47%、81.03%，可見18F-E［c(RGDfK)2］主要經(jīng)泌尿系統(tǒng)排泄。肝、胃、小腸的放射性攝取值相近且明顯低于腎臟的攝取，注射后0.5 h分別為(0.50±0.19)%ID/g、(0.71±0.28)%ID/g、(0.61±0.27)%ID/g，由此可見藥物經(jīng)消化系統(tǒng)排泄相對較少。血液、肌肉及腦組織具有低于其他組織器官的放射性攝取值，注射后0.5 h分別為(0.33±0.07)%ID/g、(0.22±0.06)%ID/g、(0.08±0.04)%ID/g(表1)。

表 118F-E［c(RGDfK)2］在正常昆明小鼠體內(nèi)生物分布Tab. 1 Biodistribution of18F-E[c(RGDfK)2] in healthy KM mice (%ID/g, n=5)

2.3 荷瘤裸鼠小動物 PET/CT顯像

注射18F-E［c(RGDfK)2］后1 h腫瘤組織清晰可見，放射性攝取最大值為(5.2±0.56)%ID/g，隨時間延長，腫瘤放射性濃聚程度略有減低，2、4 h的放射性攝取最大值分別為(4.77±0.15) %ID/g、(4.4±0.70)%ID/g(圖1)。因藥物經(jīng)泌尿系統(tǒng)排泄，故兩側(cè)腎臟可見大量生理性放射性分布，全身其余組織器官放射性攝取較低，注射后1 h，T/M比值為5.36。

2.4 荷瘤裸鼠阻斷實驗

大劑量阻斷后1 h，小動物PET/CT顯像可見腫瘤放射性攝取明顯減低(圖2)，接近本底，T/M平均值為1.57，下降了71%，說明18F-E［c(RGDfK)2］能夠與整合素αvβ3受體特異性結(jié)合。

圖 1 荷瘤裸鼠在各時相的18F-E［c(RGDfK)2］ 小動物PET/CT顯像（箭頭所指為腫瘤）Fig. 1 Representative micro PET/CT images of U87MG tumor-bearing mice at 1, 2, 4 h postinjection of 18F-E[c(RGDfK)2] (100 μCi)

圖 2 荷瘤裸鼠注射18F-E［c(RGDfK)2］后1 h的非阻斷(A)和阻斷(B)顯像(箭頭示腫瘤灶)Fig. 2 Micro PET/CT images of U87MG tumor-bearing nude mice at 1 h postinjection of 100 μCi18F-E[c(RGDfK)2] (A) and corinjection with 300 μg F-RGDfK2(B)(arrow showed tumor foci)

3 討 論

RGD多肽序列與整合素αvβ3的結(jié)合是特異性的配體-受體結(jié)合過程，因此提高結(jié)合位點局部的配體濃度以及與受體的親和性，是改善顯像效果的必要途徑。Chen等［12］和Li等［13］的研究證實，RGD二聚體比RGD單體具有更高的受體親和性、更多的腫瘤攝取及更長的瘤內(nèi)滯留時間，而RGD四聚體、八聚體則依次更勝一籌。雖然多聚體在腫瘤中攝取增高，但在腎臟等正常組織器官中也有較高的攝取，排泄時間延長，而且多聚體的合成制備較復(fù)雜。綜合上述因素，本研究選用18F標(biāo)記的RGD二聚體18F-E［c(RGDfK)2］作為分子影像探針。

18F-E［c(RGDfK)2］在U87MG膠質(zhì)瘤裸鼠體內(nèi)主要經(jīng)泌尿系統(tǒng)排泄，肝臟攝取較低，注射后1 h腫瘤攝取較高(5.2±0.56)%ID/g。血液中放射性清除迅速，注射后4 h較0.5 h下降93%，腎臟下降81%，肌肉的放射性攝取持續(xù)低水平，注射后1 h T/M為5.36，可以獲得較好的顯像效果。隨著時間延長，腫瘤的放射性攝取輕度下降(15%)，可能原因是血液清除速度較快，腫瘤組織在一定時間點后無法繼續(xù)從血液中攝取更多的18F-E［c(RGDfK)2］。潘棟輝等［14］報道，18F-E［c(RGDfK)2］注射到荷人胰腺癌BxPC-3裸鼠體內(nèi)30、60、120 min后，腫瘤區(qū)的放射性攝取值分別為(4.03±0.32) %ID/g、(3.31±0.20)%ID/g和(2.72±0.17)%ID/g，下降趨勢與本研究結(jié)果基本一致，而30 min后腸的攝取值為(1.62±0.24)%ID/g，2 h后則上升至(3.91±0.37)%ID/g，與本研究結(jié)果相反。Chen等［12］將18F-E［c(RGDfK)2］注入MDA-MB-435乳腺癌裸鼠模型中，發(fā)現(xiàn)腸道放射性攝取值亦呈現(xiàn)上升趨勢。上述2篇文獻(xiàn)在計算生物分布時，均在小動物PET/CT圖像上勾畫ROI，計算放射性濃度(GBq/L)，所得值除以注射劑量得到%ID/g(假設(shè)組織密度為1 kg/L)，所以勾畫腸道ROI時難免包含腸道內(nèi)容物及分泌物。而本研究采用正常昆明小鼠，于各時相處死獲取各臟器組織，稱重并用γ放射性免疫計數(shù)儀測量其放射性，所獲結(jié)果更為準(zhǔn)確。Chen等［12］在MDA-MB-435乳腺癌裸鼠模型中，獲得的腫瘤放射性攝取值隨時間延長有輕微上升趨勢，這可能與腫瘤模型異質(zhì)性有關(guān)。Schnell［9］等應(yīng)用18F-Galacto-RGD對惡性膠質(zhì)瘤患者行動態(tài)掃描亦得出相似結(jié)論，即腫瘤內(nèi)放射性攝取值隨時間延長逐漸下降，并認(rèn)為腫瘤組織放射性攝取值在40～60 min時處于平臺期，是進(jìn)行圖像采集及SUV分析的恰當(dāng)時段。

18F-E［c(RGDfK)2］與整合素受體特異性結(jié)合，腫瘤攝取較高、顯像清晰，適宜用于整合素表達(dá)陽性腫瘤的早期診斷、預(yù)后判斷、血管靶向治療適應(yīng)證的選擇及療效判斷。本研究中18F-E［c(RGDfK)2］的放化產(chǎn)率較低，有待進(jìn)一步提高。

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Biodistribution in healthy KM mice and micro PET/CT imaging in U87MG tumor-bearing nude mice of a new 18F-labeled cyclic RGD dimer

BAO Xiao, WANG Ming-wei, XU Jun-yan, ZHENG Yu-jia, JIANG Jin-jin, ZHANG Ying-jian (Department of Nuclear Medicine, Fudan University Shanghai Cancer Center; Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China)

Background and purpose: Integrin αvβ3receptor plays an important role in promoting, sustaining and regulating the angiogenesis. It is overexpressed on neovascular endothelial cells and tumor cells. RGD peptide specifically binds to integrin αvβ3, which could evaluate growth status and invasiveness of tumor. This study aimed to investigate the biodistribution in healthy KM mice and micro PET/CT imaging in U87MG tumor-bearing mice of18F-E[c(RGDfK)2]. Methods:18F-E[c(RGDfK)2] was produced using an automated synthesis module via a simple one-step18F-labeling strategy of the precursor 4-NO2-3-TFMBz-E[c(RGDfK)2]. The percentage activity of injection dose per gram of tissue (%ID/g) was calculated at 0.5, 1, 2, 4 h post injection of the probe. Micro PET/CT images of U87MG tumor-bearing nude mice with or without18F-E[c(RGDfK)2] blocking were acquired at each time point. Results: The labeling efficiency and radiochemical purity of18F-E[c(RGDfK)2] were 10% and 98%, respectively.18F-E[c(RGDfK)2] was excreted via renal route, with a high blood clearance. The other organs had backgroundlevel activity accumulation. At 1 h, the %ID/g of kidney, liver, intestine, muscle and blood was (1.02±0.16)%ID/g,(0.24±0.06)%ID/g, (0.35±0.03)%ID/g, (0.13±0.03)%ID/g and (0.11±0.03)%ID/g18F-E[c(RGDfK)2] had initial high tumor uptake [(5.2±0.56)%ID/g] and good tumor-to-background contrast (5.36) at 1 h post injection. Tumor uptake for blocking group was lower than those without blocking, and T/M reduced to 1.57. Conclusion:18F-E[c(RGDfK)2] appears a promising PET molecular imaging probe targeting integrin αvβ3, with high tumor uptake. It could be suitable for prognosis evaluation of integrin-positive tumor, selection of vascular targeting therapy and therapy effect monitoring.

18F-E[c(RGDfK)2]; Integrin; Nude mice bearing U87MG human glioma xenogrfts; Micro PET/CT

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.06.002

R739.4

：A

：1007-3639(2013)06-0408-05Correspondence to: ZHANG Ying-jian E-mail: yjzhang111@yahoo.com.cn

2012-11-08

2013-04-10）

國家自然科學(xué)基金(No：11275050；No：30700188)。

章英劍 E-mail:yjzhang111@yahoo.com.cn