加拿大一枝黃花總黃酮最佳提取工藝的研究

李彩景

福建省立醫(yī)院藥學(xué)部，福建 福州 350001

加拿大一枝黃花總黃酮最佳提取工藝的研究

李彩景

福建省立醫(yī)院藥學(xué)部，福建 福州 350001

目的：提取一枝黃花中總黃酮并測定含量，確定最佳提取工藝。方法：采用乙醇回流提取總黃酮，比色法測定總黃酮的含量，高效液相測定總黃酮中蘆丁含量，冷浸法測定總黃酮浸出物含量。結(jié)果：用70%的8倍于加拿大一枝黃花體積乙醇，提取3次，1.5h／次，提取效果較好。

加拿大一枝黃花；總黃酮；含量測定

加拿大一枝黃花（Solidago Canadensis L）［1］，是原產(chǎn)于北美的一種菊科多年生草本植物，20世紀30年代開始進入我國［2］，現(xiàn)在這種植物已成為我國大部分境內(nèi)迅速擴散傳播的惡性雜草。加拿大一枝黃花包含的主要成分有皂苷、揮發(fā)油和黃酮等，其乙醇提取物具有很強的抗氧化和自由基消除能力，在諸多類型天然抗氧化劑中［3］，黃酮類成分能有效減輕細胞的過氧化脅迫，阻止低密度脂質(zhì)的過氧化等作用。為了綜合利用加拿大一枝黃花，變廢為寶［4］，用植物類黃酮的獨特優(yōu)勢，確定加拿大一枝黃花總黃酮的最佳提取工藝，為后續(xù)開辟安全、無副作用的綠色化妝品提供便利［5］。

1 加拿大一枝黃花提取工藝研究

1.1 材料來源及處理 加拿大一枝黃花采自南京青龍山，加拿大一枝黃花打粉過40目篩備用［6］。

1.2 正交試驗表頭設(shè)計及總黃酮的提取

表1表頭設(shè)計

表2 正交實驗表

上述試驗藥材加熱回流得到乙醇提取液，揮去乙醇［7］，干燥后得浸膏，稱重（g），如表3。

表3 浸膏質(zhì)量

1.3 紫外法分光光度法（UV）測定樣品中總黃酮含量

1.3.1 儀器與試劑

752紫外可見分光光度計（上海精密科學(xué)儀器有限公司）

蘆丁對照品：中國藥品生物制品鑒定所（100080－200306）

甲醇：色譜純；亞硝酸鈉，硝酸鋁，氫氧化鈉：分析純；蒸餾水。

1.3.2 溶液配制

（1）5%亞硝酸鈉；10%硝酸鋁；1mol／L NAOH溶液。

稱取亞硝酸鈉2.5g置50ml燒杯中，加水配制成5%亞硝酸鈉溶液；

稱取硝酸鋁5g置50ml燒杯中，加水配制成10%硝酸鋁溶液；

稱取NaOH8g置200ml燒杯中，加水配制成1mol／L NAOH溶液。

（2）對照品溶液配制

精密稱取干燥至恒重的蘆丁對照品50mg置100ml容量瓶中，加甲醇適量，置水浴上微熱，使蘆丁溶解，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，得0.5mg／ml對照品溶液。

1.3.3 標準曲線制備

精密量取對照品溶液（0.5mg／ml）0.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0ml分別置于25ml容量瓶中，各加水至6.0ml，加5%亞硝酸鈉溶液1ml，充分搖勻，放置6min，加入10%硝酸鋁溶液1ml，充分搖勻，放置6mim，加入1mol／L NAOH溶液10ml，再加水至刻度，搖勻，放置15min，于分光光度計上以第一份溶液為空白，在510nm波長［8］，鎢燈，測定吸光度值A(chǔ)，表4，以A為縱坐標，對照品溶液濃度C為橫坐標，繪制標準曲線。如圖1，經(jīng)回歸分析得回歸方程：Y＝11.711X，相關(guān)系數(shù)R2＝0.9991，r ＝0.9995

表4 吸光度值A(chǔ)

1.4 樣品溶液總黃酮含量測定

精密稱取浸膏0.25g，置100ml容量瓶中，加甲醇至刻度，再分別量取5ml置25ml容量瓶中，照標準曲線制備項的方法，自“各加水至6ml”起依法操作，直至測定出樣品的吸光度值［9］，在根據(jù)標準曲線計算總黃酮含量，表5。

表5 樣品溶液總黃酮含量測定

1.5 高效液相（HPLC）測定樣品中蘆丁含量

1.5.1 儀器與試劑

Waters2690高效液相色譜儀，996PDA二極管矩陣檢測器，Millennium32色譜管理系統(tǒng)；

蘆丁對照品：中國藥品生物制品鑒定所（100080－200306）；甲醇：色譜純；重蒸餾水：自制。

1.5.2 方法與結(jié)果

色譜條件的選擇和系統(tǒng)適用性試驗：Alltima C18柱（4.6x250nm；5μm），柱溫為300C；以甲醇－0.4%磷酸水（30：70）為流動相，流速為1.0ml／min；檢測波長為360nm。在上述色譜條件下，理論塔板數(shù)按蘆丁計算為6130［10］。

1.5.3 溶液的配置

對照品溶液的制備：精密稱取蘆丁對照品適量，加甲醇制成每1ml含100μg的溶液。

樣品溶液的制備：精密稱取加拿大一枝黃花浸膏0.25g，置100ml容量瓶中，加甲醇至刻度。精密吸取1ml溶液置25ml容量瓶中，加甲醇至刻度。

1.5.4 方法學(xué)考察

（1）外標一點法［11］：稱取蘆丁對照品10mg，精密稱定，加甲醇制成對照品貯備液，再精密吸取上述對照品溶液0.8ml，用甲醇定容至5ml，吸取20μl對照品溶液注入液相色譜儀測定，得到其峰面積4129。

（2）樣品含量測定：分別精密吸取樣品溶液20μl注入高效液相色譜儀測定，根據(jù)外標一點法計算結(jié)果如表6：

表6 樣品含量

1.6 浸出物量的測定—冷浸法

精密稱取浸膏4g，置100ml錐形瓶中，精密加70%乙醇，密塞，冷浸，前6小時內(nèi)時時振搖，再靜置18小時，用干燥濾器濾過，取20ml濾液［12］。揮去乙醇，干燥精密稱重（g），表7。

表7 浸出物含量

2 結(jié)果與分析

采用SPSS13.0進行結(jié)果統(tǒng)計。

2.1 紫外SPSS統(tǒng)計結(jié)果

表8 總黃酮含量正交結(jié)果

2.2 HPLCSPSS統(tǒng)計結(jié)果

表9 蘆丁含量正交結(jié)果

3 正交加權(quán)統(tǒng)計結(jié)果

表10 正交加權(quán)統(tǒng)計結(jié)果

4 結(jié)論

根據(jù)紫外、液相、浸出物結(jié)果的加權(quán)，得出最佳提取工藝：70%的8倍于原藥材體積乙醇，提取3次，1.5h／次。

5 討論

加拿大一枝黃花中含有較為豐富的黃酮類成分［13］，正交試驗中影響提取的效率的四個因素（乙醇濃度，乙醇體積，提取的時間，提取的次數(shù)）中提取的時間和提取的次數(shù)影響較小，而乙醇的濃度影響顯著。所以用7%的8倍于原藥材體積乙醇，提取3次，1.5h／次，提取較完全［14］。

加拿大一枝黃花乙醇提取物具有很強的抗氧化和自由基消除能力，而活性氧與自由基的產(chǎn)生被認為與人類的眾多疾病的發(fā)生密切相關(guān)，在諸多類型天然抗氧化劑中［15］，黃酮類成分能有效減輕細胞的過氧化脅迫，阻止低密度脂質(zhì)的過氧化，預(yù)防和治療多種疾病。通過對加拿大一枝黃花黃酮化合物提取工藝的研究，可以綜合利用加拿大一枝黃花，變廢為寶［16］，同時可以擴大藥源，極大的利用資源，具有良好的社會效益［17～18］。

［1］周明華，冉俊祥，陸軍，等.應(yīng)重視強加拿大一枝黃花的防治工作［J］.植物檢疫，2005，19（4）：254－255.

［2］MCCABE P H，MCCRINDLE R，MURRAY R D H.Constituents of solidago species.Ⅰ.The constitution and strereochemistry of diterpenoids from Solidago Cabadensis L.［J］.Tetrahedron，1969，25（10）：2233－2239.

［3］MCCABE P H，MCCRINDLE R，MURRAY R D H.Constituents of solidago species.Ⅰ.The constitution and strereochemistry of diterpenoids from Solidago Cabadensis L［J］.Tetrahedron，1969，25（10）：2233－2239.

［4］MCCABE P H，MCCRINDLE R，MURRAY R D H.Constituents of solidago species.Ⅰ.The constitution and strereochemistry of diterpenoids from Solidago Cabadensis L［J］.Tetrahedron，1969，25（10）：2233－2239.

［5］McCABE P H，MCCRINDLE R，MURRAY R D H，et al.Constituents of solidago species.Ⅱ.reaction of soledagenone，the major diterpenoids form Solidago Canadensis L［J］.Tetrahedron，1970，26（13）：3091－3097.

［6］McCABE P H，MCCRINDLE R，MURRAY R D H，et al.Constituents of solidago species.Ⅱ.reaction of soledagenone，the major diterpenoids form Solidago Canadensis L［J］.Tetrahedron，1970，26（13）：3091－3097.

［7］STEPHANIE MELCHING，NILS BüLOW，KOLJA WIHSTUTZ，et al.Natural occurrence of both enantiomers of cadina－3，5－diene andδ－amorphene［J］. Phytochemistry，1997，44（7）：1291－1296.

［8］SUSAN E HEADY，ROGER G LAMBERT，CHARLES V COVELL Jr.Determination of free amino acids in larval insect and gall tissues of the goldenrod，Solidago Canadensis L［J］.Comparative Biochemistry and Physiology Part B：Biochemistry and Molecular Biology，1982，73（3）：641－644.

［9］PAPATI，K SZENTMIHáLYI，A BALáZS，et al.HPLC analysis of the flavonoids in pharmaceutical preparations from Canadian goldenrod（Solidago Canadensis）［J］.Chromatographia，2002，56（1）：S65－S68.

［10］PRAKASH CHATURVEDULA V S，BING－NAN ZHOU，ZHIJIE GAO，et al.New lupane triterpenoids from Solidago Canadensis that inhibit the lyase activity of DNA polymerase［J］.Bioorganic＆Medicinal Chemistry，2004，23（12）：6271 －6275.

［11］崔小兵，李偉，張萍，等.加拿大一枝黃花與一枝黃花中蘆丁的比較研究［J］.中國野生植物資源2008，S567.239.

［12］印麗萍，譚永彬，沈國輝，等.加拿大一枝黃花（Solidago Canadensis L.）的研究進展［J］.雜草科學(xué)，2004，4：8－11.

［13］印麗萍，譚永彬，沈國輝，等.加拿大一枝黃花（Solidago Canadensis L.）的研究進展［J］.雜草科學(xué)，2004，4：8－11.

［14］王開金，陳列忠，李寧，等.加拿大一枝黃花黃酮類成分及抗氧化與自由基消除活性的研究［J］.中國藥學(xué)雜志，2006，41（7）：493－497.

［15］中國藥典委員會，中華人民共和國藥典，一部［S］，廣州：廣東科技出版社，2005：187

［16］張勁松，李博，陳家寬，等.加拿大一枝黃花揮發(fā)油成分及其抗菌活性［J］.復(fù)旦學(xué)報：自然科學(xué)版2006，45（3）：412－416.

［17］竺傳松，竺錫武，陳海敏，等.加拿大一枝黃花提取物抑菌作用初步研究［J］.湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006（4）：76－77，80.

［18］段玉清，謝筆鈞.加拿大一枝黃花黃酮類化合物在化妝品領(lǐng)域的研究與開發(fā)現(xiàn)狀［J］.黃酮類化合物化妝品，2002，12（6）：23－26.

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1007－8517（2013）01－0028－03

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