骨松強(qiáng)骨顆粒的醇提取工藝研究

杜志謙牛瓊瓊夏華玲

（1河南省洛陽正骨醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，洛陽，471002；2河南中醫(yī)學(xué)院，鄭州，450008）

中藥研究

骨松強(qiáng)骨顆粒的醇提取工藝研究

杜志謙1，2牛瓊瓊2夏華玲1

（1河南省洛陽正骨醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，洛陽，471002；2河南中醫(yī)學(xué)院，鄭州，450008）

目的：優(yōu)選骨松強(qiáng)骨顆粒的醇提最佳工藝。方法：以提取液中淫羊藿苷含量，人參皂苷Rg1含量及總固體得率為指標(biāo)，采用正交實(shí)驗(yàn)法，優(yōu)選醇提工藝。結(jié)果：處方藥材的最佳醇提工藝為70%乙醇10倍量，提取3次，1.5 h／次。結(jié)論：優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定可行。

正交實(shí)驗(yàn)法；骨松強(qiáng)骨顆粒；醇提工藝

骨松強(qiáng)骨顆粒處方是河南省洛陽正骨醫(yī)院的經(jīng)驗(yàn)方，由淫羊藿、三七、黃芪、骨碎補(bǔ)、葛根、附子、鹿角霜、何首烏組成，具有益氣補(bǔ)腎、強(qiáng)筋壯骨、溫陽通脈、理氣止痛作用。該處方在臨床應(yīng)用10余年，療效顯著，安全性高，按新藥開發(fā)擬制成顆粒劑。用于治療原發(fā)性、繼發(fā)性骨質(zhì)疏松及骨軟化癥。根據(jù)所含的化學(xué)成分和藥理作用結(jié)合功能主治，淫羊藿、三七、骨碎補(bǔ)、葛根4種藥材采取醇提的方法。淫羊藿補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨［1］。淫羊藿所含的淫羊藿苷可促進(jìn)骨細(xì)胞的分化成熟，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖［2］，為治療骨質(zhì)疏松的有效化學(xué)成分［3］。三七為貴重藥材，三七所含的人參皂苷Rg1為其主要成分［4］，且含量較高。人參皂苷Rg1可增強(qiáng)機(jī)體免疫力［5］。因此，以淫羊藿苷含量和人參皂苷Rg1的含量及總固體得率為指標(biāo)來優(yōu)選提取條件，從而為制定生產(chǎn)工藝提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent1100 series液相色譜系統(tǒng)（美國安捷倫），XS205DU電子分析天平（瑞士梅特勒），HH-6金壇市科興儀器廠水浴鍋。

1.2 試藥 淫羊藿、三七等藥材均購自洛陽康鑫中藥飲片有限公司，經(jīng)河南中醫(yī)學(xué)院董成明教授鑒定符合《中華人民共和國藥典》2010版一部規(guī)定；淫羊藿苷對(duì)照品（110737-200415）、人參皂苷Rg1對(duì)照品（703-8903）購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇為色譜純，其余為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 醇提液的制備 采用加熱回流的提取方法［6］，選用L9（34）正交進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以加醇量（A），提取時(shí)間（B），提取次數(shù)（C），醇濃度（D）為考察因素，進(jìn)行4因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)。因素水平見表1，一次稱取處方量藥材50 g，分別稱取藥材共9份，按表2加醇液提取，藥液經(jīng)過濾即得1～9號(hào)樣品。

表1 因素水平表

2.2 淫羊藿苷含量的測(cè)定［7］

2.2.1 色譜條件［8-9］色譜柱安捷倫C18柱；乙腈∶水（28∶72）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長270 nm；柱溫35℃；理論塔板數(shù)淫羊藿苷峰計(jì)算應(yīng)不低于1500。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取淫羊藿苷1.9 mg對(duì)照品，置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，制成0.19 mg／mL的溶液，分別精密吸取0.1 mL，0.2 mL，0.3 mL，0.4 mL，0.5 mL，0.6 mL，0.7 mL上述溶液，用甲醇分別稀釋至1mL。過濾后分別吸取20μL注入液相色譜儀。按上述色譜條件測(cè)峰面積。以淫羊藿苷的濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)線性回歸，得回歸方程為Y＝39532X+66.986，R2＝0.9998，表明淫羊藿苷在0.019～0.133mg／mL范圍內(nèi)線性良好。

2.2.3 供試品溶液的制備［10］按處方量稱取藥材提取，精密移取提取液2 mL，蒸干，加稀乙醇，定容至10 mL。

2.2.4 對(duì)照品溶液的制備 取淫羊藿苷對(duì)照品1.6 mg，加甲醇定容至10 mL容量瓶中，制成每0.16 mg／mL的溶液。

2.2.5 陰性溶液的制備 稱取處方量缺淫羊藿的其余藥材提取，照供試品的制備方法制備陰性溶液。

2.2.6 含量測(cè)定 分別精密吸取過0.45μm濾膜的對(duì)照品溶液，供試品溶液、陰性溶液各20μL注入液相色譜儀。HPLC圖見圖1，結(jié)果見表2。

表2 L9（34）正交實(shí)驗(yàn)表

2.3 三七中人參皂苷Rg1含量測(cè)定［11］

2.3.1 色譜條件［12-13］色譜柱安捷倫C18；乙腈為流動(dòng)相A，水為流動(dòng)相B；檢測(cè)波長為203 nm，柱溫35℃；流動(dòng)相比例如下圖表3，理論板數(shù)按人參皂苷Rg1算應(yīng)不低于4000。

表3 流動(dòng)相比例

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取人參皂苷Rg1標(biāo)準(zhǔn)品12.5 mg，放入10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，制成1.25 mg／m L的溶液，分別精密吸取0.1 mL，0.2 mL，0.3 mL，0.4 mL，0.5 mL，0.6 mL，0.7 mL的上述溶液加甲醇至1 mL。分別精密吸取20μL，按上述色譜條件注入液相色譜儀。以人參皂苷Rg1的濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)線性回歸，回歸方程為Y＝7421.7X+105.86，R2＝0.9997，表明人參皂苷Rg1在0.125～0.875 mg／mL范圍內(nèi)線性良好。

2.3.3 供試品溶液的制備［14］按處方量稱取藥材50 g提取，精密量取乙醇提取液10 mL，蒸干加20 mL水溶解，水溶液用水飽和的正丁醇萃取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，棄水液，用正丁醇飽和的氨試液洗滌2次，每次20 mL，合并正丁醇液，用正丁醇飽和的水液洗滌1次，每次60 mL，取正丁醇層，蒸干，用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中。

2.3.4 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取人參皂苷Rg1對(duì)照品4.7 mg，加甲醇定容至10 mL容量瓶中。制成含人參皂苷Rg10.47 mg／mL的溶液。

2.3.5 陰性溶液的制備 按處方量稱取缺三七的其余藥材提取，照供試品的方法制備陰性溶液。

2.3.6 含量測(cè)定 精密吸取過0.45μm濾膜的對(duì)照品溶液，供試品溶液、陰性溶液各20μL注入液相色譜儀。HPLC圖見圖2，結(jié)果見表2，方差分析見表4。

2.4 總固體得率的測(cè)定［15］精密量取樣品液30 mL至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后在105°C干燥箱中干燥5 h，于干燥器內(nèi)冷卻至室溫，待恒重時(shí)精密稱定，計(jì)算總固體得率，見表2。

2.5 結(jié)果 分析極差值知因素對(duì)結(jié)果影響大小順序?yàn)椋杭逯蟠螖?shù)＞加水量＞煎煮時(shí)間＞乙醇濃度。由方差分析知各影響因素對(duì)結(jié)果影響都不顯著，由直觀分析知最佳組合為A1B2C3D3.即10倍醇液，每次煎煮1.5 h，煎煮3次，乙醇濃度為70%。

圖1 為淫羊藿的HPLC圖（注：A為淫羊藿苷的對(duì)照品溶液；B為樣品溶液；C為陰性溶液；1為淫羊藿苷）

圖2 三七的HPLC圖（D為三七中人參皂苷Rg1的對(duì)照品溶液；E為樣品溶液；F為陰性溶液圖；2為人參皂苷Rg1）

表4 方差分析表

2.5.1 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 分別稱取藥材以最優(yōu)的工藝提取，按“2.2”和“2.3”項(xiàng)下測(cè)定淫羊藿苷含量和三七中人參皂苷Rg1的含量，測(cè)定總固體得率。驗(yàn)證3批結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

淫羊藿苷含量測(cè)定時(shí)參照《中華人民共和國藥典》2010版方法，由于復(fù)方組成的干擾，對(duì)流動(dòng)項(xiàng)的比例進(jìn)行了選擇，調(diào)整為乙腈∶水為28∶72，就得到理想的峰形和保留時(shí)間。三七中人參皂苷Rg1的含量測(cè)定時(shí)供試品溶液的制備方法進(jìn)行了優(yōu)選：1）以乙醇提取液取10 mL，蒸干加甲醇溶解并定容至10 mL；2）先將乙醇提取液取10 mL蒸干加20 m L水溶解，水溶液用水飽和的正丁醇液萃取3次，每次20 mL，棄水液，正丁醇液合并，用正丁醇飽和的水液60 mL洗滌正丁醇液，取正丁醇液蒸干，加甲醇溶解并定容至10 mL；3）先將乙醇提取液10 mL蒸干加20 mL水溶解，水溶液用水飽和的正丁醇萃取3次，每次20 mL，棄水液，正丁醇液合并，用正丁醇飽和的氨試液洗滌2次，每次20 mL，合并正丁醇液，用正丁醇飽和的水洗滌1次，每次60 mL，取正丁醇層，蒸干，用甲醇溶解并定容至10 mL。經(jīng)比較第3種方法色譜圖簡潔，分離度好，保留時(shí)間合適，選擇該方法為供試品溶液的制備方法。人參皂苷Rg1的含量測(cè)定經(jīng)比較，優(yōu)選了流動(dòng)相比例，以流動(dòng)相B為例，0～12 min為19，12～60 min為19～36；0～6 min為19，6～30 min為19～26；0～6 min為22，6～28 min為22～26；最終又改為比例0～6 min為21，6～28 min為21～26。

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（2013-04-28收稿）

Study on the Alcohol Extraction Process for Gusong Qianggu Granule

Du Zhiqian1，2，Niu Qiongqiong2，Xia Hualing1
（1 Henan Luoyang Orthopedic Hospital，Luoyang 471002，China；2 Henan University of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450008，China）

Objective：To optimize the alcohol extraction process of GuSong QiangGu Granule.M ethods：Orthogonal test was employed for selecting the optimum of alcoholextraction process by the indexes of the contents of ginsenoside Rg1 and total solidmatters.Results：Ten times amount of70%ethanol concentration，extracting 3 timeswith 1.5 hours for each time was considered the optimum alcohol extraction process of Gusonng Qianggu Granule.Conclusion：The optimum alcohol extraction process condition was stable and feasible. Key W ords Orthogonal test；GuSong QiangGu Granule；Alcohol extraction process

10.3969／j.issn.1673-7202.2013.11.028

牛瓊瓊，女，在讀碩士，研究方向：中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究，E-mail：niuqiongqiongmengjin＠126.com