二維斑點追蹤成像評價新生豬缺氧缺血性腦病模型受損心肌圓周運動

新生兒缺氧缺血性腦病（HIE）是由圍生期窒息所致的嚴重新生兒疾病，心臟是常見的受累器官之一。利用超聲心動圖對HIE患兒心功能進行檢測可早期評價新生兒HIE并發(fā)心功能損害[1,2]，但針對心肌運動進行檢測和定量評價的研究較少。二維斑點追蹤成像（STI）技術(shù)能夠通過測量心肌在各個運動方向的應(yīng)變來反映和評價整體及局部心肌真實的運動情況和功能狀態(tài)[3]。本研究在新生豬HIE模型的基礎(chǔ)上，利用STI技術(shù)測量心肌圓周應(yīng)變及圓周應(yīng)變率（SrC），以期了解缺氧缺血性心肌損傷后心肌圓周運動的變化，觀察心肌組織的病理改變，為研究新生兒HIE合并心肌損傷提供動物實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物模型建立 新生3～5 d健康雄性約克豬18只，體重2～2.5 kg，隨機抽簽分為對照組（n=8）和模型組（n=10）。模型組：溫度保持在28～30℃，于無菌條件下行腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉、氣管插管（φ2.5 mm）、機械通氣（TKR-200C小動物呼吸機）。經(jīng)頸旁正中切口鈍性剝離并阻斷雙側(cè)頸總動脈，同時機械通入6% O2與94% N2混合氣體30 min，監(jiān)測心率及血氧飽和度。造模結(jié)束后恢復(fù)雙側(cè)頸總動脈血供，吸入40% O2，進行縫合、包扎。對照組：手術(shù)過程同模型組，但不阻斷雙側(cè)頸總動脈血流，機械通入40%O2。待意識恢復(fù)后撤掉呼吸機及氣管插管，置于恒溫箱中（設(shè)定溫度＞32℃），維持體溫38.5～39.5℃，以0.9%NaCl注射液5 ml/（kg?h）靜脈滴注補液，能進食后每6小時給予奶粉30～60 ml。出現(xiàn)心率下降（＜100次/min）時，每次給予腎上腺素0.01 mg/kg靜脈注射，出現(xiàn)抽搐給予苯巴比妥鈉20 mg/kg靜脈注射，維持量5 mg/（kg?d）靜脈滴注，嚴重時呼吸機維持機械通氣（40% O2）[4]。1.2 超聲檢查 模型制備24 h后行超聲檢查。采用GE Vivid 7超聲顯像儀，7S探頭，探頭頻率2.5～6.0 MHz，麻醉后取左側(cè)臥位，連接同步導(dǎo)聯(lián)心電圖。于胸骨旁采集基底段、中間段和心尖段短軸二維動態(tài)圖像，幀頻75～140幀/s，保存5個心動周期，在EchoPAC工作站對圖像進行脫機分析。選擇清晰圖像，定幀于收縮期末，手動勾畫感興趣區(qū)（ROI），調(diào)整ROI至各節(jié)段追蹤滿意，獲得各節(jié)段心肌圓周應(yīng)變及應(yīng)變率曲線。設(shè)定R波頂點為舒張期末，測量主動脈瓣關(guān)閉時間確定收縮期末，心動周期在兩個R波頂點之間。記錄各節(jié)段圓周應(yīng)變峰值（SC）、收縮期圓周應(yīng)變率峰值（SrC S）、舒張早期圓周應(yīng)變率峰值（SrC E）、舒張晚期圓周應(yīng)變率峰值（SrC A），計算基底段、中間段、心尖段及整體水平平均值，記錄心率。利用改良Simpson法[5]測量并計算左心室射血分數(shù)（LVEF）。計算Tei指數(shù)[2]：二尖瓣環(huán)后間隔處組織多普勒頻譜Aa峰結(jié)束至Ea峰開始時間為A，Sa峰開始至結(jié)束時長為B，Tei=（A―B）/B。

1.3 重復(fù)性檢驗 隨機抽簽從對照組和模型組中各抽取4只豬，由2名相同資歷的檢查者按上述方法追蹤獲取各節(jié)段心肌圓周應(yīng)變曲線，計算整體水平SC；同一檢查者于不同時間對同一病例測量2次。比較檢查者間及檢查者內(nèi)的一致性。

1.4 病理檢查 超聲檢查結(jié)束后處死新生豬，用10%KCl 10 ml靜脈注射，取基底節(jié)區(qū)腦組織、左心室前乳頭肌及其旁室壁心肌組織用10%福爾馬林溶液固定，進一步脫水包埋切片，腦組織切片行HE染色，心肌組織切片行HE染色及凋亡檢測（POD法，博士德MK1020）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件，對照組與模型組間計量資料比較采用成組t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。重復(fù)性檢驗采用Bland-Altman分析，采用GraphPad Prism 5繪圖。

2 結(jié)果

2.1 造模情況 模型組新生豬造模后皮膚、口鼻發(fā)紺，全身抽搐，四肢呈“劃槳樣”運動，頭部顫抖，頸強直；對照組未見明顯異常運動。兩組新生豬實驗期間均未出現(xiàn)死亡。

2.2 兩組左心室心肌圓周應(yīng)變及應(yīng)變率比較 模型組基底段、中間段、心尖段及整體水平SC、SrC S、SrC E、SrC A均低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1、圖1。

2.3 兩組心率及心功能比較 模型組心率較對照組快，LVEF較對照組低，Tei指數(shù)較對照組高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

2.4 重復(fù)性檢驗 Bland-Altman分析圖顯示，檢查者間及檢查者內(nèi)測值一致性均較高。

2.5 心肌組織凋亡檢測及病理檢查 對照組心肌組織切片胞核均藍染；模型組可見散在胞核呈金棕色（圖2）。對照組心肌細胞排列整齊，胞核清晰，細胞無腫脹；模型組心肌細胞腫脹，排列紊亂，部分胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)空泡，部分胞核腫脹、淡染，核膜、核仁顯示不清（圖3）。對照組神經(jīng)元胞質(zhì)豐富，核清晰可見，核仁清楚；模型組神經(jīng)膠質(zhì)細胞腫脹，神經(jīng)元細胞胞質(zhì)淡染、出現(xiàn)空泡，部分神經(jīng)元細胞膜破壞，胞核腫脹、淡染，核膜、核仁顯示不清（圖4）。

表1 新生豬HIE模型組與對照組各水平圓周應(yīng)變峰值及圓周應(yīng)變率比較

圖1 對照組（A）與模型組（B）中間段短軸圓周應(yīng)變曲線，與對照組比較，模型組中間段短軸各節(jié)段應(yīng)變峰值減低，曲線形態(tài)低平、不規(guī)整

圖2 心肌凋亡檢測。模型組（B）可見凋亡心肌細胞胞核（箭），而對照組（A）胞核均勻藍染（HE, ×400）

圖3 心肌組織病理示模型組（B）心肌細胞胞核不清（箭），而對照組（A）胞核清晰（HE, ×400）

圖4 腦組織病理示模型組（B）基底節(jié)神經(jīng)元細胞胞質(zhì)空泡（箭），胞核不清（箭頭），而對照組（A）胞質(zhì)豐富，胞核清晰（HE, ×400）

表2 新生豬HIE模型組與對照組心率及心功能指標比較

3 討論

新生豬與新生兒的體型大小及生長發(fā)育等較為相近，通過暫時性全腦缺血加機械低氧通氣建立新生豬HIE模型的實驗方法，缺氧條件穩(wěn)定，重復(fù)性良好，對新生兒HIE模擬結(jié)果較可靠[4]。本實驗中模型組新生豬腦組織細胞變性，部分可見壞死，證實造模成功。

HIE造成心肌損傷的機制為：①缺氧后無氧酵解增加，引起細胞內(nèi)酸中毒；ATP生成障礙引起細胞膜離子泵功能受損；線粒體損傷與細胞內(nèi)鈣超載導(dǎo)致鈣依賴性酶的激活；上述原因?qū)е履ち字到狻⒌鞍踪|(zhì)分解甚至DNA水解，造成組織細胞變性、壞死、凋亡等[6,7]。②腦損傷造成繼發(fā)性心肌損傷，包括兒茶酚胺合成增多、交感與副交感神經(jīng)支配失衡以及肽能神經(jīng)作用等，可以加重心肌缺氧缺血，引起心律紊亂及心血管反射調(diào)節(jié)紊亂等[8]。本實驗中模型組心肌組織內(nèi)可檢測到散在的凋亡細胞，而對照組則無凋亡發(fā)生；既往研究[9]曾報道模型組心肌HE染色結(jié)果，但凋亡檢測情況鮮有報道。

模型組LVEF低于對照組，Tei指數(shù)高于對照組，均表明造模后左心室功能下降。既往利用超聲心動圖技術(shù)對早期評價新生兒HIE并發(fā)心功能損害有一定意義[1,2]，如LVEF能反映左心室整體泵血功能下降，Tei指數(shù)能反映左心室整體功能降低，M型超聲能夠發(fā)現(xiàn)室壁運動幅度及左心室短軸縮短率降低。心肌應(yīng)變及應(yīng)變率能夠同時反映局部及整體心肌在各個方向的運動，可進一步觀察HIE合并心肌損傷所致的心肌運動異常。心肌應(yīng)變指心肌在心動周期中由心肌纖維的收縮和舒張運動所引起的形變，反映心肌的機械特性，心肌整體和各節(jié)段的應(yīng)變值可以用來評價相應(yīng)的心肌功能。STI技術(shù)利用軟件對心肌組織內(nèi)部回聲斑點的空間運動進行追蹤識別，跟蹤其在每一幀圖像中的位置，描記其在心動周期中的運動軌跡，以此來計算心肌運動多項參數(shù)，分析心肌運動的力學(xué)特征；同時克服了聲束方向、角度及取樣位置等的限制，能夠從縱向、徑向、圓周等方向?qū)π募∵\動進行研究，定性、定量地反映心肌運動狀態(tài)和功能[3]。

模型組左心室基底段、中間段、心尖段及整體水平心肌圓周應(yīng)變峰值及各時相應(yīng)變率峰值均較對照組明顯減低，心肌圓周應(yīng)變及應(yīng)變率曲線較對照組低平，說明造模后各節(jié)段心肌組織圓周方向收縮、舒張運動均受到損傷。圓周運動是心肌短軸方向的環(huán)形運動，其應(yīng)變值反映了室壁在心動周期中環(huán)形的縮短與伸長的程度，是左心室心肌一種較為重要的運動方式。Yan等[10]研究顯示，在射血分數(shù)保留（LVEF＞45%）的冠狀動脈疾病患者中，存在碎片狀QRS波（fQRS）的患者與非fQRS患者相比，各水平圓周應(yīng)變明顯減低，整體水平圓周應(yīng)變降低是fQRS的危險因素，能夠預(yù)測心臟不良事件。王其海等[11]研究發(fā)現(xiàn)，冠狀動脈不同程度狹窄患者相關(guān)節(jié)段圓周應(yīng)變較正常對照組減低，其圓周應(yīng)變峰值絕對值與冠狀動脈狹窄程度呈負相關(guān)。

造模后24 h，新生豬心肌損傷表現(xiàn)為細胞變性，偶見點灶狀壞死，并出現(xiàn)散在的心肌細胞凋亡。在心肌細胞損傷的基礎(chǔ)上，左心室心肌收縮期與舒張期圓周運動均明顯減弱，說明HIE合并心肌損傷時圓周方向環(huán)形肌纖維受累，而心肌圓周應(yīng)變及應(yīng)變率檢測可以早期評價新生兒HIE合并心肌損傷。由于心肌細胞是不可再生細胞，未來若能建立局部心肌細胞壞死、凋亡程度與相應(yīng)節(jié)段應(yīng)變及應(yīng)變率峰值的關(guān)系，將對新生兒HIE合并心肌損傷的預(yù)后有重要臨床意義。

由于STI技術(shù)易受到圖像質(zhì)量的制約而產(chǎn)生追蹤和測量誤差。本研究中使用的7S探頭常用于嬰幼兒檢查，不是專用的動物探頭，但7S探頭分辨力尚好，3～5 d新生豬與同日齡新生兒軀干部分大小相似，心臟體積接近，且胸壁較薄，圖像質(zhì)量尚好。造模后心率加快，需要及時增加幀頻，當直接調(diào)節(jié)到極限時，需要犧牲圖像寬度和深度來進一步增加幀頻，確保曲線質(zhì)量。通過抽樣進行的重復(fù)性檢驗顯示，本研究中數(shù)據(jù)測量在檢查者間及檢查者內(nèi)一致性均較好。

總之，利用新生豬HIE模型能夠復(fù)制新生兒HIE合并心肌損傷，通過STI技術(shù)檢測圓周應(yīng)變及應(yīng)變率能夠早期評價新生豬HIE的心肌損傷情況，可以為新生兒HIE合并心肌損傷的研究提供動物實驗基礎(chǔ)，為新生兒窒息后多器官缺氧缺血性損傷的深入研究提供可靠的動物模型。

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