老年大鼠股骨頸骨折術(shù)后認(rèn)知功能及Aβ1～40、Bax、Bcl-2的改變

凌云志 禹 莉 梁?jiǎn)?李曉紅

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院麻醉科，安徽 蚌埠 233004)

術(shù)后認(rèn)知功能障礙(POCD)是指手術(shù)后數(shù)天內(nèi)發(fā)生的意識(shí)、認(rèn)知、定向、思維、記憶以及睡眠等方面的紊亂，是老年患者術(shù)后早期較為顯著的問(wèn)題〔1〕。Berggren等〔2〕發(fā)現(xiàn)老年患者股骨頸骨折固定術(shù)后POCD的發(fā)生率高達(dá)44%，POCD發(fā)病機(jī)制尚無(wú)定論。本實(shí)驗(yàn)以股骨頸骨折的老年SD大鼠作為研究對(duì)象，旨在觀察股骨頸骨折麻醉術(shù)后對(duì)老年大鼠認(rèn)知功能的影響及可能影響認(rèn)知功能的指標(biāo)，進(jìn)一步探討POCD的發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選用18～20個(gè)月齡的健康清潔級(jí)SD大鼠35只，雌雄各半，體重450～500 g，由江蘇省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水。隨機(jī)分為3組:K組(n=7)為空白組，不做任何麻醉及手術(shù)處理;D組(n=14)為對(duì)照組，僅制作股骨頸骨折模型;S組(n=14)為手術(shù)組，制作股骨頸骨折模型，麻醉后行股骨頸骨折內(nèi)固定術(shù)。D組、S組大鼠根據(jù)處理時(shí)間的不同各分為2個(gè)亞組，每組7只，分別為處理后1 d、3 d組(即 D1、D3 組;S1、S3 組)。

1.2 手術(shù)處理 老年大鼠左股骨頸骨折模型制作成功后，肌注氯胺酮90～100 mg/kg，待大鼠翻正反射消失后仰臥位固定，保持氣道通暢。切開右腹股溝皮膚，游離暴露股靜脈，然后進(jìn)行小兒B-D套管針置管，建立靜脈通道，乳酸鈉林格注射液靜脈維持輸液，固定包埋套管針，縫合皮膚。常規(guī)消毒鋪巾，在左側(cè)股骨頸骨折部位，選擇后外切口，切開皮膚、筋膜，分離肌層，暴露骨折斷端，使用1.0 mm克氏針行骨折斷端交叉固定，徹底止血后，逐層關(guān)閉縫合傷口，青霉素鈉粉劑灑在傷口表面，術(shù)中呼吸平穩(wěn)。術(shù)后傷口愈合好，分籠喂養(yǎng)，無(wú)手術(shù)死亡。

1.3 材料 大鼠Aβ1～40ELISA試劑盒(上海雅吉生物科技有限公司);RT-PCR試劑盒(MBI Fermentas公司);Trizol試劑(Invitrogen公司)。

1.4 方法

1.4.1 Morris水迷宮測(cè)試 Morris水迷宮為一直徑120 cm、高55 cm的圓形水池，水池內(nèi)壁被漆為黑色，池內(nèi)水深42 cm，水溫保持在(25±2)℃，房間內(nèi)光照恒定，無(wú)光線反射在水池內(nèi)，周圍參照物保持不變。池壁上以4個(gè)等距離點(diǎn)將水池分為四個(gè)象限，將平臺(tái)置于第四象限低于水面2 cm。各組大鼠均在術(shù)前3天開始Morris水迷宮學(xué)習(xí)，每天固定時(shí)間進(jìn)行，選擇一個(gè)象限的固定位置將大鼠入水，以入水起至找到平臺(tái)的時(shí)間為潛伏期，如在120 s內(nèi)未找到平臺(tái)，則潛伏期記為120 s。每天測(cè)試8次。第8次訓(xùn)練時(shí)撤除平臺(tái)，然后在原入水點(diǎn)將大鼠面向池壁放入水中，測(cè)其在120 s內(nèi)跨過(guò)原平臺(tái)所在位置的次數(shù)。第4天D組和S組制作股骨頸骨折模型，S組麻醉后行股骨頸骨折內(nèi)固定術(shù)。術(shù)后1 d和3 d水迷宮測(cè)試時(shí)，手術(shù)切口用防水貼膜貼附，以防傷口進(jìn)水引起感染。測(cè)試至完成均未發(fā)現(xiàn)傷口被大鼠咬噬裂開和感染，傷口愈合情況良好。

1.4.2 取材 水迷宮實(shí)驗(yàn)完成后抽取大鼠心臟血液2 ml，放置30 min自然凝固后，3 000 r/min離心10 min，取上清，－20℃保存用于檢測(cè)血清Aβ1～40。斷頭處死，迅速開顱取腦，于冰臺(tái)上分離出海馬組織，－80℃凍存用于RT-PCR檢測(cè)。

1.4.3 RT-PCR檢測(cè)Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá) 參照Trizol試劑說(shuō)明書提取組織總RNA。取3 ml總RNA為模板，用隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以此2 ml cDNA為模板，PCR擴(kuò)增，所用引物見(jiàn)表1，引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系終體積為25 ml，反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3 min，94℃變性 30 s，59℃退火 30 s，72℃延伸 45 s，36 個(gè)循環(huán)后 72℃平衡7 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，Smart view圖像分析處理系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5軟件分析，數(shù)據(jù)采用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)。

表1 擴(kuò)增目的基因及內(nèi)參照的引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度

2 結(jié)果

2.1 水迷宮行為測(cè)試結(jié)果 D1、D3、S1、S3組大鼠逃避潛伏期與K組相比差異顯著(P＜0.01)，S1、S3組與D1組相比差異顯著(P＜0.01，P＜0.05)，S1、S3組與 D3組相比差異顯著(P＜0.01)。D1、D3、S1、S3組大鼠穿過(guò)原平臺(tái)的次數(shù)與K組相比差異顯著(P＜0.01，P＜0.05)，S1組與D1組相比差異顯著(P＜0.05)，S1、S3組與 D3組相比差異顯著(P＜0.05)，見(jiàn)表2。

2.2 血清Aβ1～40檢測(cè) 與K組相比〔(192.75±22.74)μg/L〕，D 組、S組血清 Aβ1～40濃度均升高(P ＜0.05)，以 D3組、S1組、S3組更為顯著〔(243.65±32.11)、(274.74±31.34)、(297.36±36.13)μg/L，(P ＜0.01)〕;與 D1組相比〔(232.71±27.62)μg/L〕，S1組、S3組差異顯著(P＜0.05);與D3組相比，S3組差異顯著(P＜0.01)。

表2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=7

表2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=7

與K組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與 D1組比較:3)P＜0.05，4)P ＜0.01;與D3組比較:5)P ＜0.05，6)P ＜0.01，下表同

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2.3 半定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 圖1，圖2為Bcl-2、Bax mR-NA表達(dá)的凝膠成像。電泳圖譜經(jīng)光密度掃描分析，將各泳道灰度與GAPDH條帶灰度的比值作為Bcl-2、Bax mRNA的相對(duì)值。Bcl-2 mRNA的表達(dá)中，D1、D3、S1、S3組與K組相比差異顯著(P＜0.01，P＜0.05)。Bax mRNA 表達(dá)中，S1、S3組與 K、D1、D3組相比差異顯著(P＜0.01)。Bcl-2/Bax值可見(jiàn) D1、S1、S3組與K組相比差異顯著(P＜0.01)，S1、S3組與D1組相比差異顯著(P＜0.05)，S1、S3組與 D3組相比差異顯著(P＜0.01)，見(jiàn)表 3。

表3 RT-PCR檢測(cè)Bax、Bcl-2 mRNA的表達(dá)(n=3

表3 RT-PCR檢測(cè)Bax、Bcl-2 mRNA的表達(dá)(n=3

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3 討論

POCD是一種麻醉、手術(shù)后較為嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，由于病因仍不很清楚，給臨床上預(yù)防和治療帶來(lái)一定困難。POCD在流行病學(xué)、病因?qū)W、發(fā)病機(jī)制、治療和預(yù)防等許多方面均存在許多未知領(lǐng)域，因此為了預(yù)防或減少老年病人POCD的發(fā)生，有必要深入探討POCD的具體發(fā)病機(jī)制，發(fā)現(xiàn)更多的與POCD聯(lián)系的標(biāo)志分子，為POCD的預(yù)測(cè)、診斷和治療提供指標(biāo)和方向。

Morris水迷宮是一種研究與海馬功能直接相關(guān)的空間學(xué)習(xí)記憶模型。逃逸潛伏期表明獲取空間信息的能力，而穿過(guò)原平臺(tái)的次數(shù)表明記憶貯存及提取再現(xiàn)能力。本研究提示老年大鼠股骨頸骨折術(shù)后空間辨別學(xué)習(xí)和記憶能力出現(xiàn)下降，行為學(xué)測(cè)試結(jié)果說(shuō)明大鼠已出現(xiàn)明顯的認(rèn)知功能障礙。

血漿Aβ水平是預(yù)測(cè)阿爾茨海默病(AD)發(fā)展和評(píng)價(jià)治療AD藥物療效的神經(jīng)生化指標(biāo)，是進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和記憶力減退的病理基礎(chǔ)〔3〕。Aβ是跨膜糖蛋白-淀粉樣β蛋白前體異常代謝的產(chǎn)物，分兩種類型:Aβ1～40和 Aβ1～42，Aβ1～40在腦脊液中占Aβ的90%，老年人和AD患者腦內(nèi)Aβ1～40/Aβ1～42顯著升高〔4〕。說(shuō)明老年大鼠股骨頸骨折術(shù)后認(rèn)知功能下降可能與血清Aβ1～40濃度升高有關(guān)。

海馬是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中研究動(dòng)物或人認(rèn)知功能的經(jīng)典腦區(qū)。既往研究報(bào)道大鼠認(rèn)知功能受損與海馬神經(jīng)元的凋亡有密切關(guān)系〔5〕。Bcl-2、Bax是有關(guān)細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控基因，其中Bax是促凋亡基因，可使細(xì)胞器釋放出某些分子，引起半胱氨酸蛋白酶的活化，并拮抗Bcl-2的保護(hù)效應(yīng)而使細(xì)胞趨于凋亡，或者通過(guò)啟動(dòng)線粒體通透性轉(zhuǎn)變的方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔6〕。Bcl-2編碼蛋白屬于線粒體膜蛋白，是重要的抗凋亡基因，又稱為“生存基因”，表達(dá)水平與細(xì)胞壽命呈正相關(guān)。Bcl-2和Bax可以形成異源二聚體，也可各自形成同源二聚體。Bcl-2/Bax值是一定的，這一比例的增大或減小會(huì)決定是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡還是抑制細(xì)胞凋亡〔7〕。本研究表明，老年大鼠在股骨頸骨折術(shù)后出現(xiàn)了短暫的認(rèn)知功能障礙，血清Aβ1～40濃度升高以及海馬內(nèi)Bcl-2/Bax比例降低導(dǎo)致的神經(jīng)元損害可能與術(shù)后認(rèn)知功能障礙有關(guān)。

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