翻白草油對RSV感染宿主HeLa細胞Bcl-2蛋白和Bax蛋白表達的影響

劉 蕾 陳 光 王躍新 王淑秋 張鵬霞 王柏欣 王 薇

(佳木斯大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，黑龍江 佳木斯 154007)

呼吸道合胞病毒(RVS)是一群分布十分廣泛的RNA病毒，可以感染呼吸道、心肌等，并造成流行性傳播〔1～3〕。翻白草(Potentilla discolor Bunge)，又名雞腿兒、雞腳草、天青地白、白頭翁、葉下白，為薔薇科委陵菜屬植物翻白草的全草，具有解毒、清熱、止血消腫和止痢的作用，可治療痢疾、瘧疾、肺癰、癤癰、咯血、崩漏、瘡癬?，F(xiàn)代醫(yī)學研究其具有降低血糖、抗病毒、抗菌和降低血脂〔4～6〕等豐富的藥理作用，且毒副作用低。

1 材料與方法

1.1 材料 HeLa細胞株和RSV病毒株由佳木斯大學病理生理學教研室保存。翻白草油由本實驗室提取，血清、RPMI1640培養(yǎng)液、雙抗(青霉素-鏈霉素)均購自美國GIBCO公司;β-actin、兔源Bcl-2多克隆抗體、兔源Bax和辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔IgG抗體購自美國Santa公司;脫脂奶粉購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) HeLa細胞株在10%RPMI1640細胞培養(yǎng)液(10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素)，37℃，5%CO2培養(yǎng)，約80%以上融合時取0.25%胰蛋白酶－0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化，傳代。

1.2.2 藥物配制 用細胞維持液(含2%胎牛血清)將翻白草油(65.6 mg/ml)按1∶20、1∶40等比例進行2倍倍比稀釋，0.22μm濾器抽濾除菌，4℃條件下保存。

1.2.3 病毒毒力測定 病毒毒力用50%細胞感染量(CCID50)表示。將 RSV液從10－1～10－10做10倍系列稀釋。將各稀釋度的RSV液接種HeLa細胞，設(shè)陰性對照，且每一稀釋度設(shè)8個復(fù)孔，培養(yǎng)3～5 d，觀察和記錄細胞病變(CPE)。CCID50用Reed-Muench法求出。

1.2.4 翻白草油對HeLa細胞毒性測定 將不同濃度的翻白草油分別加入HeLa細胞已長成單層的96孔細胞培養(yǎng)板中，每個濃度重復(fù)8個復(fù)孔，同時設(shè)立正常細胞對照，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，連續(xù)觀察3 d，記錄細胞形態(tài)變化。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，吸棄培養(yǎng)板中液體，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，每孔加入MTT(5 mg/ml)20μl，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，去上清后每孔加DMSO 200μl，微量振蕩器振蕩5 min，酶標讀數(shù)儀比色(波長490 nm)測吸光度值。實驗重復(fù)3次。

1.2.5 翻白草油抗RSV的作用方式 每一濃度設(shè)4個培養(yǎng)瓶，實驗同時設(shè)病毒對照。(1)藥物配制:用2%RPMI1640維持液(含2%胎牛血清)將翻白草油進行稀釋濃度為0.1、0.025、0.006 3 mg/ml，0.22 μm 微孔濾器抽濾除菌，4℃ 保存?zhèn)溆谩?2)100 CCID50RSV病毒液配制:用2%RPMI1640維持液將RSV病毒原液1 000倍稀釋，0.22μm微孔濾器抽濾除菌，4℃保存?zhèn)溆谩?3)對RSV的直接滅活作用:不同濃度的翻白草油分別與100 CCID50RSV液等量混合，37℃作用2 h后，將其接種HeLa細胞，37℃吸附2 h后，棄上清，加5 ml維持液。(4)在生物合成階段對RSV的作用:在長成單層Hela細胞上，接種0.5 ml的100 CCID50RSV病毒病毒液，37℃吸附2 h，棄病毒液，加入不同濃度的翻白草油5 ml。不同濃度的翻白草油分別與100 CCID50RSV液等量混合，立即加入HeLa細胞中，37℃，吸附2 h后，棄培養(yǎng)瓶液體，加入維持液5 ml。(6)藥物對細胞預(yù)處理作用:預(yù)先加入不同濃度的翻白草油5 ml于HeLa細胞，37℃條件下，作用4 h后，PBS洗3次后，加入100 CCID50RSV液0.5 ml，37℃條件下，吸附2 h，棄RSV液上清，加入細胞維持液5 ml。

1.2.6 Western印跡檢測Bcl-2蛋白和Bax蛋白的影響 裂解細胞樣品，測定蛋白含量，100℃、5 min蛋白變性，經(jīng)100 V、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離后，260 mA電轉(zhuǎn)移到聚偏二氯乙烯(PVDF)膜，Tris鹽酸緩沖液(TBST)緩沖液漂洗。5%脫脂奶粉37℃封閉1 h，TBST漂洗，Bcl-2蛋白或Bax蛋白兔源多克隆抗體4℃過夜孵育，TBST漂洗，HRP標記二抗37℃，90 min，TBST漂洗。增強化學發(fā)光法(ECL)顯色試劑顯色，對照Marker記錄實驗結(jié)果。將結(jié)果進行拍照，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標條帶的凈光密度值。

1.3 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS統(tǒng)計軟件進行分析，方差分析調(diào)用Proc GLM過程，組間比較采用Dunnet t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 RSV毒力測定 用普通光學倒置顯微鏡觀察CPE，與HeLa細胞對照組相比，RSV作用的HeLa細胞收縮變圓，典型串珠樣改變。72 h后，CPE陽性細胞為50%HeLa細胞出現(xiàn)病變;CPE陰性細胞未出現(xiàn)細胞病變。通過Reed-Muench法計算RSV液對HeLa細胞的毒力為105.8CCID50/L，本實驗病毒攻擊量為103CCID50/L。

2.2 翻白草油對宿主Hela細胞毒性作用 翻白草油對宿主HeLa細胞毒性作用表現(xiàn)為細胞增殖緩慢、細胞皺縮變圓、顆粒增多、折光性增強、部分細胞出現(xiàn)破碎脫落等，HeLa細胞活力隨著翻白草油濃度的降低，逐漸增加，翻白草油的最小毒性濃度是0.10 mg/L。見圖1。

2.3 Western印跡檢測翻白草油對RSV感染宿主HeLa細胞Bax蛋白和Bcl-2蛋白的影響 翻白草油(除翻白草油預(yù)處理作用方式)組與病毒組比較，宿主HeLa細胞Bax蛋白的表達明顯降低(P＜0.05)，而Bcl-2蛋白的表達明顯增加(P＜0.05)。見圖2。

3 討論

植物揮發(fā)油的主要成分是倍半萜烯、萜烯、酯和醇等。研究發(fā)現(xiàn)，其具有抗癌、抗菌和抗病毒等多種藥理作用〔7〕，因此，植物揮發(fā)油的研究日益受到人們的重視。翻白草油是傳統(tǒng)中藥翻白草的揮發(fā)油，是傳統(tǒng)中藥，性味苦，平。翻白草應(yīng)用歷史悠久，《本草綱目》和《救荒本草》等醫(yī)藥典籍記載，功用主要為治痢疾、瘡疥、祛風濕和解毒等?，F(xiàn)代藥理學研究證實翻白草具有降低血糖、血脂和抗病毒、抗菌等多種藥理作用。但抗RVS作用的研究較少。

細胞凋亡是生命的基本特征之一，一種由基因調(diào)控的而使細胞主動有序的死亡過程，是機體生長發(fā)育、細胞分化、生理及病理性死亡的重要機制。細胞凋亡與細胞增殖共同維持機體正常生長發(fā)育和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。細胞增殖與凋亡失控導(dǎo)致許多疾病的發(fā)生。凋亡一般由細胞外的調(diào)節(jié)因素與其在細胞表面的受體結(jié)合而啟動。

Bax/Bcl-2系統(tǒng)介導(dǎo)的細胞凋亡途徑是目前研究較為深入的有關(guān)細胞凋亡的信號傳導(dǎo)。細胞凋亡的發(fā)生和發(fā)展取決于促凋亡與抑凋亡成員間的相對濃度，Bax和Bc1-2是Bcl-2癌基因家族中功能相反的兩個重要成員，分別為促凋亡類蛋白抗凋亡類蛋白，Bcl-2/Bax比值決定細胞是否進入內(nèi)源性凋亡途徑，當Bax占優(yōu)勢時，細胞進入線粒體依賴的內(nèi)源性凋亡途徑，反之，則不能進入〔8〕。Bax在正常細胞中主要分布在細胞質(zhì)，在凋亡刺激因子的作用下，可以發(fā)生轉(zhuǎn)位與線粒體相互作用，破壞線粒體膜的完整性，使線粒體內(nèi)某些促凋亡分子外流，進而活化基質(zhì)金屬蛋白酶(caspase-9)，激活caspases-3分子，啟動細胞凋亡過程〔9〕。Bc1-2在線粒體外膜和 bax結(jié)合形成異構(gòu)二聚體阻止bax對線粒體的損傷，以維持線粒體膜的完整性，抑制細胞凋亡Bax/Bcl-2系統(tǒng)介導(dǎo)的細胞凋亡〔10〕。病毒感染與宿主細胞凋亡有著密切的聯(lián)系，病毒感染宿主細胞后，通過各種機制參與宿主細胞凋亡的誘導(dǎo)〔11，12〕，

本研究結(jié)果提示RSV可能通過抑制凋亡抑制基因 Bcl-2的表達，增加凋亡促進基因Bax的表達，導(dǎo)致caspase-3被激活，通過內(nèi)源性(線粒體途徑)誘導(dǎo)Hela細胞凋亡。另外，在三種作用方式下翻白草油抗RSV作用可能與抑制RSV引起的宿主細胞凋亡有關(guān)。翻白草油抗RSV病毒中線粒體途徑起主要作用，但對于該過程具體的調(diào)控機制、相關(guān)的分子機制以及是否涉及其他信號分子，可能還有其他途徑參與，還需做進一步的實驗研究。

1 Verger JT，Verger EE.Respiratory syncytial virus bronchiolitis in children〔J〕.Crit Care Nurs Clin North Am，2012;24(4):555-72.

2 代立娟，王 琳，馮 瀾.肉桂醛抗呼吸道合胞病毒的作用〔J〕.中國老年學雜志，2013;33(6):1309-12.

3 Li QG，Wu XR，Li XZ，et al.Neural-endocrine mechanisms of respiratory syncytial virus-associated asthma in a rat model〔J〕.Genet Mol Res，2012;11(3):2780-9.

4 Xiu LM，Miura AB，Yamamoto K，et al.Pancreatic islet regeneration by ephedrine in mice with streptozotocin-induced diabetes〔J〕.Am J Chin Med，2001;29(3-4):493-500.

5 Evstropov AN，Burova LG，Grek OR，et al.Experimental therapy of coxsackie B3 virus infection with immunomodulator contained in water-soluble penthaphylloides fruticosa extract〔J〕.Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol，2005;3:102-4.

6 Subbotina MD，Timchenko VN，Vorobyov MM，et al.Effect of oral administration of tormentil root extract(potentilla tormentilla)on rotavirus diarrhea in children:a randomized，double blind，controlled trial〔J〕.Pediatr Infect Dis J，2003;22(8):706-11.

7 Yoon WJ，Moon JY，Kang JY，et al.Neolitsea sericea essential oil attenuates LPS-induced inflammation in RAW 264.7 macrophages by suppressing NF-kappaB and MAPK activation〔J〕.Nat Prod Commun，2010;5(8):1311-6.

8 Mohammad RM，Goustin AS，Aboukameel A，et al.Preclinical studies of TW-37，a new nonpeptidic small-molecule inhibitor of Bcl-2，in diffuse large cell lymphoma xenograft model reveal drug action on both Bcl-2 and Mcl-1〔J〕.Clin Cancer Res，2007;13(7):2226-35.

9 Kim BM，Chung HW.Hypoxia/reoxygenation induces apoptosis through a ROS-mediated caspase-8/Bid/Bax pathway in human lymphocytes〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2007;363(3):745-50.

10 Li YZ，Lu DY，Tan WQ，et al.p53 initiates apoptosis by transcriptionally targeting the antiapoptotic protein ARC〔J〕.Mol Cell Biol，2008;28(2):564-74.

11 Han X，Li Z，Chen H，et al.Influenza virus A/Beijing/501/2009(H1N1)NS1 interacts withβ-tubulin and induces disruption of the microtubule network and apoptosis on A549 cells〔J〕.PLoSOne，2012;7(11):e48340.

12 Crane M，Iser D，Lewin SR.Human immunodeficiency virus infection and the liver〔J〕.World J Hepatol，2012;4(3):91-8.