三葉青水提物體內(nèi)、體外抗腫瘤作用的研究

丁 麗， 紀(jì)其雄， 呂雯婷， 王玉連

（浙江醫(yī)藥高等專科學(xué)校，浙江寧波 315100）

三葉青水提物體內(nèi)、體外抗腫瘤作用的研究

丁 麗， 紀(jì)其雄， 呂雯婷， 王玉連

（浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，浙江寧波 315100）

目的 考察三葉青水提物體內(nèi)、體外抗腫瘤的作用。方法 應(yīng)用中藥血清藥理學(xué)方法，制備三葉青水提物的含藥血清。采用MTT法觀察不同質(zhì)量濃度三葉青水提物及其含藥血清對(duì)人宮頸癌細(xì)胞Hela229和人惡性黑色素瘤細(xì)胞A375細(xì)胞的體外抑制作用；以小鼠S180肉瘤為模型，觀察三葉青水提物在體內(nèi)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。結(jié)果 三葉青水提物對(duì)Hela229和A375細(xì)胞有增殖抑制作用，且呈現(xiàn)出劑量依賴性，IC50分別為45.60 g/L和38.35 g/L；三葉青水提物含藥血清高、中、低 （20，10，5 g/kg）劑量組也可抑制Hela229和A375細(xì)胞的體外增殖，IC50分別為41.82 g/L和248.60 g/L，呈現(xiàn)出劑量依賴性；三葉青水提物在體內(nèi)對(duì)小鼠S180肉瘤的生長(zhǎng)具有一定的抑制作用，高、中、低（24，12，6 g/kg）劑量組的抑瘤率分別為28.24%、41.56%和6.00%。結(jié)論 三葉青水提物體內(nèi)、體外均具有抗腫瘤作用。

三葉青；水提物；抗腫瘤；含藥血清；Hela229細(xì)胞；A375細(xì)胞；S180

三葉青Tetrastigma hemsleyanum是葡萄科植物，以塊根或全草入藥，在浙江地區(qū)常被用來(lái)治療小兒驚厥高熱、肺炎、支氣管炎、肝炎及病毒性腦膜炎等癥［1］。有報(bào)道稱三葉青對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有抑制作用［2-6］。本課題組前期研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，三葉青石油醚和三氯甲烷兩個(gè)提取部位對(duì)A375、Hela229、5637及AGS等腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用［7］，三葉青的三氯甲烷提取部位還能抑制A375細(xì)胞中黑色素的合成［8］。還發(fā)現(xiàn)三葉青水提物及其小鼠含藥血清對(duì)人胃腺癌細(xì)胞株AGS腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)地體外抑制作用。因此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了三葉青水提物及其含藥血清對(duì)Hela229和A375細(xì)胞的體外抑制作用，并以S180荷瘤小鼠為模型進(jìn)行了體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)，為三葉青抗腫瘤的作用機(jī)制及活性成分的研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材 三葉青塊根飲片購(gòu)自寧波市鄞州醫(yī)藥藥材公司，經(jīng)浙江醫(yī)藥高等專科學(xué)校中藥系楊雄志教授鑒定為Tetrastigma hemsleyanum Diels et.Gilg。

1.2 細(xì)胞株 人宮頸癌細(xì)胞株Hela 229、人惡性黑色素瘤細(xì)胞株A375和小鼠S180肉瘤細(xì)胞由本校細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室凍存。

1.3 動(dòng)物 清潔級(jí)昆明種小鼠，雄性，體質(zhì)量 （18～26）g，購(gòu)自浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào) SCXK（浙）20080033。

1.4 儀器與試藥 iMark酶標(biāo)儀 （美國(guó)Bio-Rad公司），AE21型倒置生物顯微鏡 （Motic中國(guó)公司），HF160W型CO2培養(yǎng)箱 （中國(guó)力申科學(xué)儀器有限公司）。MTT購(gòu)于美國(guó)Amresco公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；胎牛血清購(gòu)于上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；胰島素購(gòu)自上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；注射用環(huán)磷酰胺購(gòu)自山西普德藥業(yè)有限公司。

2 方法

2.1 藥物配制

2.1.1 三葉青水提物制備 取三葉青飲片，碾碎，加水適量，回流提取3次，每次1 h，合并提取液，過(guò)濾，棄去藥渣，濾液濃縮，揮去溶劑得三葉青水提物 （每1 g三葉青水提物相當(dāng)于1.43 g飲片），備用。

2.1.2 細(xì)胞抑制試驗(yàn)供試液制備 取三葉青水提物適量，加水適量溶解，離心，取上清液濃縮至生藥含有量為1.0 g/mL的供試溶液，調(diào)節(jié)其pH值為 7.0～7.2，分別用含10%（體積分?jǐn)?shù)）小牛血清的培養(yǎng)液稀釋制成質(zhì)量濃度為20、40、60、80、100 g/L的溶液，過(guò)濾除菌，備用。

2.1.3 小鼠含藥血清制備 隨機(jī)將小鼠分為5組，每組20只，分別為三葉青水提物高、中、低劑量組［9］（分別相當(dāng)飲片20、10、5 g/kg），陽(yáng)性對(duì)照 （注射用環(huán)磷酰胺，0.1 g/kg）組及陰性對(duì)照組。各組均灌胃給藥 （陰性對(duì)照組給予蒸餾水［10］），每次20 mL/kg，連續(xù)3 d，每天2次，最后1次給藥前禁食12 h，灌胃1 h后斷頭取血，分離血清，56℃滅活30 min后，過(guò)濾除菌，冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)胞培養(yǎng) Hela 229和A375以含10%（體積分?jǐn)?shù)）滅活小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，在37℃，含5%（體積分?jǐn)?shù)）的CO2，飽濕條件下培養(yǎng)。

2.3 體外抑制試驗(yàn) （MTT法） 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela 229和A375細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，細(xì)胞密度為2.5×104個(gè)/L，每孔200 μL；24 h后，吸除培養(yǎng)板內(nèi)原培養(yǎng)液，每孔加入不同質(zhì)量濃度的三葉青水提物溶液或含藥血清各200 μL，前者以每孔200 μL含10%小牛血清的培養(yǎng)液為空白對(duì)照，后者以每孔200 μL含10%陰性對(duì)照組血清但不含細(xì)胞的培養(yǎng)液為空白對(duì)照，以每孔200 μL含10%（體積分?jǐn)?shù)）含藥血清的培養(yǎng)液為陰性對(duì)照，每劑量組均設(shè)6復(fù)孔，37℃、5%（體積分?jǐn)?shù)）CO2、飽濕條件下培養(yǎng)48 h后，每孔加入MTT液 （5 g/L）20 μL，4 h后，吸除上清液，加入150 μL DMSO終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度 （A）值。計(jì)算抑制率 （%）。

細(xì)胞抑制率（%）=（1－A藥物/A對(duì)照）×100%

2.4 體內(nèi)抗腫瘤試驗(yàn) 取腹腔接種7～9 d生長(zhǎng)良好的荷S180小鼠4～5只，斷頸處死。無(wú)菌抽取1～2 mL腹水，再用無(wú)菌生理鹽水按1∶3比例稀釋成瘤細(xì)胞懸液，并用0.4%苔盼藍(lán)染色，計(jì)活細(xì)胞率＞90%，調(diào)整瘤細(xì)胞密度為1×107個(gè)/mL。取50只小鼠，每只小鼠右前肢腋下皮下接種0.2 mL。接種次日，按體質(zhì)量隨機(jī)分成5組，每組10只。陰性對(duì)照組灌胃給予等體積的蒸餾水；陽(yáng)性對(duì)照組腹腔注射用環(huán)磷酰胺0.02 g/（kg·d）；三葉青水提物高、中、低劑量組分別灌胃給予相當(dāng)于飲片24、12、6 g/（kg·d）的藥物。每日1次，連續(xù)10 d。末次給藥24 h后稱質(zhì)量，脫臼處死動(dòng)物，剪開腫瘤部位，完整剝離瘤塊，用濾紙吸凈其上血和液體，稱取瘤塊質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率。并且分離胸腺和脾臟，精密稱定質(zhì)量，計(jì)算胸腺和脾臟指數(shù)。

3 結(jié)果

3.1 三葉青水提物對(duì)Hela 229和A375細(xì)胞的抑制作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組比較，一定質(zhì)量濃度范圍的三葉青水提物和環(huán)磷酰胺處理48 h的Hela 229和A375細(xì)胞抑制率隨質(zhì)量濃度的增加均有顯著地升高 （P＜0.01）（見表1）。Hela 229和 A375腫瘤細(xì)胞 IC50分別為45.60 g/L和 38.35 g/L。

表1 三葉青水提物對(duì)Hela229和A375細(xì)胞的抑制作用 （±s，n=6）

表1 三葉青水提物對(duì)Hela229和A375細(xì)胞的抑制作用 （±s，n=6）

注：和陰性組比較，#P＜0.01（表2、表3同）。

組 別 質(zhì)量濃度/（g·L－1）Hela229 A375抑制率/% IC50/（g· L－1） 抑制率/% IC50/（g·L－1）陰性對(duì)照00000三葉青水提物 1 5.79±5.50 10.72±10.77 20 25.81±8.1# 26.19±11.00 40 44.93±8.60#45.60 50.69±12.13#60 56.31±4.19# 82.06±9.28#80 95.43±0.45# 95.03±6.49#100 97.31±0.29# 98.51±0.45#注射用環(huán)磷酰胺 0.1 70.48±5.45# － 79.77±5.46#38.35－

3.2 三葉青水提物含藥血清對(duì)Hela 229和A375細(xì)胞的抑制作用 結(jié)果見表2。與陰性對(duì)照組比較，三葉青水提物含藥血清對(duì)Hela 229和A375細(xì)胞具有顯著地抑制作用 （P＜0.01），且呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，IC50分別為 41.82 g/L和248.60 g/L。Hela 229細(xì)胞對(duì)三葉青水提物高、中、低劑量組含藥血清的敏感性與三葉青水提物直接作用于該細(xì)胞時(shí)的結(jié)果相似，而三葉青水提物含藥血清對(duì)A375細(xì)胞抑制作用不如三葉青水提物。

表2 含藥血清對(duì)Hela 229和A375細(xì)胞體外抑制作用的影響（x ± s，n=6）

3.3 體內(nèi)腫瘤抑制試驗(yàn) 三葉青水提物高、中、低劑量組對(duì)小鼠S180肉瘤的抑制作用與陰性對(duì)照組比較，高、低劑量組無(wú)明顯差異，而中劑量組表現(xiàn)出非常顯著的差異 （P＜0.01）；與陰性對(duì)照組比較，各劑量組小鼠脾臟指數(shù)和胸指腺數(shù)均呈下降趨勢(shì)，低劑量組與高劑量組下降較多，其胸腺指數(shù)有顯著差異性 （P＜0.05）；中劑量組下降較少（P＞0.05）。見表3。

表3 三葉青水提物對(duì)荷S180小鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用（x ± s，n=10）

4 討論

有報(bào)道稱從三葉青中分離得取了6'-O-苯甲酰基胡蘿卜苷、胡蘿卜苷、β-谷甾醇［10］、麥角醇、蒲公英萜酮［11］，山柰酚-3-O-新橙皮糖苷、槲皮素［12］、5，7，4'-三羥基黃酮-6-α-L-吡喃鼠李糖 （1-4）-α-L-吡喃阿拉伯糖苷，5，7，4'-三羥基黃酮-8-α-L-吡喃鼠李糖 （1-4）-α-L-吡喃阿拉伯糖苷和5，7，4'-三羥基黃酮-6，8-二-C-β-D-吡喃葡萄糖苷［13］。其中的6'-O-苯甲酰基胡蘿卜苷、三葉青黃酮有抗腫瘤作用［3，5，10］。前期實(shí)驗(yàn)對(duì)三葉青脂溶性提取物做了體外腫瘤細(xì)胞抑制試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其有較強(qiáng)的細(xì)胞毒作用［7-8］。有人從三葉青中提取出了多糖成分［14］，本課題組認(rèn)為三葉青中可能存在水溶性的多糖成分，因此有必要研究三葉青水提物的抗腫瘤作用，便于以后全面研究三葉青中的抗腫瘤活性成分。三葉青水提物是粗制劑，體外試驗(yàn)受其中雜質(zhì)的影響，可能會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性或假陰性的結(jié)果。所以本實(shí)驗(yàn)同時(shí)采用中藥血清藥理學(xué)的方法及小鼠體內(nèi)、體外試驗(yàn)。

從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，三葉青水提物對(duì)Hela 229和A375細(xì)胞均有較強(qiáng)地體外抑制作用，采用中藥血清藥理學(xué)方法則發(fā)現(xiàn)三葉青含藥血清對(duì)Hela 229仍表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒作用，而對(duì)A375細(xì)胞的抑制作用稍弱，但二者的抑制作用均呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。試驗(yàn)結(jié)果還表明，三葉青水提物對(duì)小鼠S180肉瘤的有一定地抑制作用，且不表現(xiàn)出劑量依賴性。中劑量組 （12 g/kg）的抗腫瘤作用優(yōu)于高劑量組 （24 g/kg）與低劑量組 （6 g/kg）；與陰性對(duì)照組比較，其脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù)均有所下降，提示三葉青水提物可能含有毒性作用的雜質(zhì)，或者三葉青水提物本身可能具有毒性。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體內(nèi)外抗腫瘤試驗(yàn)，表明三葉青具有明顯的抗腫瘤活性。結(jié)果顯示三葉青抗腫瘤的機(jī)制并不是通過(guò)提高宿主免疫功能的途徑，其作用機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。另外三葉青的抗腫瘤活性成分還未知，作者將繼續(xù)研究，為開發(fā)利用三葉青提供依據(jù)。

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R285.5

B

1001-1528（2013）05-1076-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2013.05.053

2012-10-22

浙江省教育廳2010年度科研項(xiàng)目 （Y201019049）

丁 麗 （1979—），女，碩士，講師，研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及中藥藥理學(xué)。E-mail：nbncdl@163.com