附子無姜不熱的成分研究

葉 強(qiáng)， 郭一平， 彭 成， 郭 力

（成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川成都 611137）

附子無姜不熱的成分研究

葉 強(qiáng)， 郭一平， 彭 成， 郭 力﹡

（成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川成都 611137）

目的 以附子與生姜、干姜、炮姜配伍前后生物堿的變化，探討附子與干姜配伍的科學(xué)意義。方法 分別采用溴甲酚綠染色法、異羥肟酸鐵染色法測定附子總生物堿、酯型生物堿配伍前后的變化，結(jié)合HPLC指紋圖譜研究附子與姜類藥材配伍前后總體成分變化。結(jié)果 附子配伍干姜使總生物堿增加，而附子配伍生姜、炮姜使總生物堿減少；附子配伍生姜、干姜、炮姜均使酯型生物堿減少，附子酯型生物堿的量為干姜＞生姜＞炮姜；從指紋圖譜分析可知附子生姜配伍后，附子成分總加權(quán)變化率為115.75%，生姜為135.53%；附子干姜配伍后，附子成分總加權(quán)變化率為143.48%，干姜為72.09%；附子炮姜配伍后，附子成分總加權(quán)變化率為81.00%，炮姜為133.53%。結(jié)論 附子配伍干姜能促進(jìn)附子有效成分的溶出，減少附子毒性成分溶出；附子配伍生姜，降低了附子的有效成分和毒性成分，附子配伍炮姜，大幅降低附子有效成分和毒性成分。

附子；配伍；生姜；干姜；炮姜；總生物堿；酯型生物堿；指紋圖譜

復(fù)方用藥是中醫(yī)藥的特點(diǎn)和優(yōu)勢，藥對，又稱“對藥”、是臨床上常用的、相對固定的兩味藥物的配伍形式，是中藥配伍的最小單位［1］。藥對并非兩味藥物的隨機(jī)組合，而是從歷代醫(yī)藥學(xué)家用藥經(jīng)驗(yàn)積累中提煉出來的，其功用勝于單味藥，多使藥效增強(qiáng)，或作用全面，或減低、消除毒副作用［2］。漢代張仲景使用附子，回陽救逆必用生者與干姜作伍，后世醫(yī)家亦多有應(yīng)用，如干姜附子湯和四逆湯等，故有“附子無姜不熱之說”［3］；溫經(jīng)散寒諸方，附子多配生姜，如桂枝附子湯和真武湯；《世醫(yī)得效方》中炮姜與附子同用，用于脾虛冷瀉和寒性吐血、便血不止之證。附子與姜類藥材配伍是傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論中的經(jīng)典藥對，本實(shí)驗(yàn)以附子分別配伍生姜、干姜、炮姜為研究對象，研究配伍前后物質(zhì)基礎(chǔ)的變化，為附子配伍姜類藥材傳統(tǒng)理論提供科學(xué)詮釋。

1 試劑試藥與儀器設(shè)備

烏頭堿 （Aconitine 0720-200807，AC）、新烏頭堿 （Mesaconitine 0799-200403，MA）、次烏頭堿（Hypaconitine 0798-200403，HA）均購自中國藥品生物制品檢定所；甲醇、乙腈、四氫呋喃 （Fisher HPLC Grade），自制重蒸餾水，其余試劑均為分析純。附子為毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaeliDebx.的子根切片低溫干燥加工品，產(chǎn)地四川江油，購自四川江油恒源藥業(yè)有限公司；生姜、干姜和炮姜分別為姜科植物姜Zingiber officinaleRosc.的新鮮根莖、干燥根莖和以干姜砂燙至鼓起，表面棕褐色入藥炮制加工品，均產(chǎn)自四川犍為，購于成都新荷花飲片公司。由成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室嚴(yán)鑄云教授鑒定，符合藥典要求。

Agilent1200型 HPLC色譜儀 （DAD、Agilent工作站）、P-E紫外/可見分光光度計(jì)、Sartorius十萬分之一電子天平、Buch旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、Dikma Dianonsil C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）。

2 方法與結(jié)果

附子總生物堿 （TA）類成分被認(rèn)為是其主要藥效組分，酯型生物堿 （EA）既是有效組分也是毒性組分［4］，故本實(shí)驗(yàn)采用溴甲酚綠染色法測定配伍前后附子總生物堿、異羥肟酸鐵染色法測定附子酯型生物堿，并結(jié)合指紋圖譜揭示其總體成分的變化情況。

2.1 附子總生物堿測定 （溴甲酚綠染色法［5］）

2.1.1 對照品溶液的配制 取烏頭堿對照品約8 mg，精密稱定7.78 mg，置50 mL量瓶中，加適量三氯甲烷溶解并加至刻度，搖勻，即得0.1556 mg/mL烏頭堿對照品溶液。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取烏頭堿對照品溶液0、0.5、1.0、1.25、1.5、2.5 mL，分別置于分液漏斗中，加入20 mL三氯甲烷，然后各加入10 mL pH6.1的溴甲酚綠溶液，充分振搖，靜置，三氯甲烷層置于25 mL量瓶中并用三氯甲烷稀釋至刻度。將烏頭堿溴甲酚綠顯色溶液在波長200～700 nm進(jìn)行紫外全波長掃描，在415 nm處有最大吸收，故選定415 nm為測定波長。以第一份溶液為空白對照，于415 nm波長處，測定吸光度。分別以生物堿量、吸光度為橫縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程：Y=1.220 9X－0.045 5，r=0.999，線性范圍為0.078～0.389 mg，方法學(xué)考察均符合要求。

2.1.3 樣品測定 結(jié)果見表1。

附子配伍生姜，TA變化范圍為59.91%～74.45%，配伍后TA有所降低，但幅度較??；附子配伍干姜，TA變化范圍為103.96% ～131.72%，配伍后TA有大幅升高；附子配伍炮姜，TA變化范圍為40.29%～50.66%，配伍后TA有較大幅度降低。

2.2 附子酯型生物堿測定 （異羥肟酸鐵染色法［6］）

2.2.1 對照品溶液的配制 取烏頭堿對照品約20mg，精密稱定20.4 mg，置10 mL量瓶中，加少許無水乙醇溶解，加無水乙醇至刻度，搖勻，即得2.04 mg/mL烏頭堿對照品溶液。

表1 總生物堿測定結(jié)果 （n=3）Tab.1 Total alkaloids content determination results about ALRP respectively compatible with ginger species herbs（n=3）

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取烏頭堿對照品溶液 0、0.25、0.5、0.75、1.5、2.0、2.5 mL，分別置25 mL量瓶中，均精密加入無水乙醇使成2.5 mL，各精密加入堿性鹽酸羥銨試液1.5 mL，搖勻，在60～65℃水浴中保溫10 min，放冷，加高氯酸鐵試液13 mL，搖勻，放置5 min，精密加入高氯酸試液8 mL，用高氯酸鐵試液稀釋至刻度，搖勻，放置15 min，按紫外-可見分光光度法于200～700 nm處進(jìn)行全波長掃描，在520 nm處有最大吸收。以第一份溶液為空白對照，于520 nm處測定吸光度，分別以生物堿量與吸光度為橫縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程：Y=0.091 8X－0.005 4，r=0.998，線性范圍為0.51～5.10 mg，方法學(xué)考察均符合要求。

2.2.3 樣品測定 結(jié)果見表2。

表2 酯型生物堿測定結(jié)果 （n=3）Tab.2 Ester alkaloids content determination results about ALRP respectively compatible with ginger species herbs（n=3）

附子配伍生姜，EA變化范圍為50.82%～60.66%；附子配伍干姜，EA變化范圍為75.41%～96.72%，降低幅度相對較??；附子配伍炮姜，EA變化范圍為29.51% ～47.54%，降低幅度相對較大。

2.3 附子與姜類藥材配伍指紋圖譜研究 由于藥材中的成分相當(dāng)復(fù)雜，因此本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步采用指紋圖譜研究，從宏觀方面分析藥材配伍的物質(zhì)基礎(chǔ)變化情況。為使實(shí)驗(yàn)條件統(tǒng)一可控，選擇 （1∶1）配伍比例作為研究對象。

2.3.1 色譜條件 流動相 A為乙腈-四氫呋喃（25∶15），流動相B為0.1 mol/L醋酸銨溶液，按表3進(jìn)行梯度洗脫，體積流量1 mL/min；柱溫30℃；DAD檢測器。

表3 梯度洗脫條件Tab.3 Gradient elution conditions

2.3.2 供試品溶液的制備 分別取附子、生姜、干姜、炮姜粗粉各約5 g，再取附子配伍生姜、干姜、炮姜 （1∶1）粗粉各約10 g，精密稱定，按2010年版《中國藥典》方法制備［7］。

2.3.3 附子配伍生姜指紋圖譜研究 依法測定，見圖1。

圖1 附子配伍生姜HPLC指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprintsofALRP compatible fresh ginger

從圖1可知，附子單煎液主要有7個特征峰，按附子藥材編號順序?qū)Ψ暹M(jìn)行編號，生姜有3個，配伍后均可檢測。將附子的7個峰按峰面積進(jìn)行加權(quán)，計(jì)算其加權(quán)變化率，以判斷其成分的總體變化狀況，同時對生姜各成分進(jìn)行加權(quán)計(jì)算，見表4。

加權(quán)變化率：j=a×w

表4 附子配伍生姜后附子與生姜成分總加權(quán)變化率 （%）Tab.4 ALRP＆fresh ginger components total weighted rate of variation after ALRP compatible with fresh ginger（%）

2.3.4 附子配伍干姜指紋圖譜研究 見圖2，計(jì)算其加權(quán)變化率，見表5。

圖2 附子配伍干姜HPLC指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprints of ALRP compatible dried ginger

表5 附子配伍干姜后附子與干姜成分總加權(quán)變化率 （%）Tab.5 ALRP＆dried ginger components total weighted rate of variation after ALRP compatible with dried ginger（%）

分析數(shù)據(jù)可知，附子配伍干姜后，附子各成分總加權(quán)變化率為143.48%，總體上附子成分有所增加；干姜各成分的總加權(quán)變化率為72.09%，總體上干姜成分有所減少。

2.3.5 附子配伍炮姜指紋圖譜研究 加權(quán)變化率見表6。圖譜見圖3。

表6 附子配伍炮姜后附子與炮姜成分總加權(quán)變化率 （%）Tab.6 ALRP＆sand-fried ginger components total weighted rate of variation after ALRP compatible with sand-fried ginger（%）

圖3 附子配伍炮姜HPLC指紋圖譜Fig.3 HPLC fingerprints of ALRP compatible sandfried ginger

分析數(shù)據(jù)可知，附子配伍炮姜后，附子各成分總加權(quán)變化率為81.00%，總體上附子成分有所減少；炮姜各成分總加權(quán)變化率為133.53%，總體上炮姜成分有所增加。

3 結(jié)論與討論

3.1 附子總生物堿 附子配伍干姜使總生物堿增加，而附子配伍生姜、炮姜使總生物堿減少。附子配伍姜類藥材，附子總生物堿的量為干姜＞生姜＞炮姜，這說明生姜能減少附子有效成分的溶出，從而可以降低附子辛熱之性，可能使其回陽救逆和補(bǔ)火助陽的作用被抑制，而使附子發(fā)揮溫經(jīng)散寒除痹的功效；干姜能促進(jìn)附子有效成分的溶出，從而保持附子辛熱之性，更好地發(fā)揮附子回陽救逆的功效；炮姜能顯著減少有效成分的溶出，從而使附子發(fā)揮溫經(jīng)、散寒除痹的功效。現(xiàn)代研究表明，生姜、干姜、炮姜主要含姜萜酮、β-沒藥烯、β-姜黃烯等揮發(fā)油成分，還含辛辣的姜辣醇、姜酮、姜酚等成分［8］，三種姜類藥材成分并無特殊，但姜類藥材在加工炮制的過程中加熱的程度不同，可導(dǎo)致其成分的量有較大差異。生姜為新鮮藥材揮發(fā)油損失少，也是最高的，但含水較高。干姜是生姜曬干或低溫干燥產(chǎn)品、其水分降低，揮發(fā)油中的低沸點(diǎn)成分揮發(fā)減少，姜辣素類成分卻是最高的。炮姜是干姜經(jīng)過砂燙的加工炮制品，砂燙溫度通常在150～200℃之間，使水分進(jìn)一步蒸發(fā)，同時其所含揮發(fā)油中的高沸點(diǎn)成分也會揮發(fā)損失，姜辣素類成分也會破壞降低。本實(shí)驗(yàn)中，姜類藥材與附子配伍時，只有干姜使總生物堿增加，可能是其水分較少，所含高沸點(diǎn)揮發(fā)油和姜辣素起到了增溶的作用。張宇等研究表明附子干姜合煎液中烏頭類生物堿含有量增至36.40%，可能是干姜中所含的高分子化合物有增溶作用［9］。總生物堿的測定結(jié)果表明傳統(tǒng)論述“附子無姜不熱”，這里所說的“姜”應(yīng)為干姜，而非生姜、炮姜。展海霞等實(shí)驗(yàn)證明［10-11］，干姜與附子相伍可改善冠脈血流量，加快心率，改善心衰大鼠血流動力學(xué)。同時，干姜可明顯拮抗附子對心臟毒性、減少心肌能量需求，達(dá)到回陽救逆目的。

3.2 附子酯型生物堿 附子配伍生姜、干姜、炮姜均使酯型生物堿減少，附子酯型生物堿的量排序?yàn)楦山旧九诮＿@說明生姜能減少附子毒性，也降低附子辛熱之性，誠如傳統(tǒng)配伍理論所指生姜?dú)⒏阶又?；干姜使附子酯型生物堿含有量有所減少，但降低幅度相對較小，與文獻(xiàn)一致［12］，由于酯型生物堿既是附子的熱性成分又是毒性成分，因此與干姜配伍既有減毒的作用又有調(diào)節(jié)附子藥性的作用；炮姜能顯著減少酯型的溶出，從而大幅度降低毒性，也大幅度減少附子辛熱之性。越皓等采用HPLC-MS對干姜配伍附子進(jìn)行分析，得出干姜成分與附子雙酯型生物堿反應(yīng)生成單脂型生物堿，且抑制了雙酯型生物堿的溶出，從而達(dá)到解毒的目的［13］。故生姜、干姜、炮姜均可解附子之毒，抑制附子毒性。

3.3 指紋圖譜 附子配伍生姜后，附子各成分總加權(quán)變化率為115.75%，附子總體成分有所增加，可使附子發(fā)揮其溫里散寒的作用；生姜各成分總加權(quán)變化率分別為135.53%，生姜總體成分大幅上升，這主要是促進(jìn)了生姜揮發(fā)油的溶出，從而保持生姜發(fā)汗解表的作用。附子配伍干姜后，附子各成分總加權(quán)變化率為143.48%，附子總體成分有較大幅度增加，促進(jìn)附子中成分的溶出從而發(fā)揮附子的回陽救逆的作用，這與張麗等的研究結(jié)果相類［14］，從另一方面說明“附子無姜不熱”是指附子配伍干姜；干姜各成分總加權(quán)變化率為72.09%，總體上干姜成分有所減少。附子配伍炮姜后，附子各成分總加權(quán)變化率分為81.00%，附子總體成分有所減少，使其不致太過辛熱；炮姜各成分總加權(quán)變化率為133.53%，炮姜總體成分也大幅增加，可能是炮姜在炮制過程中，成分大幅下降導(dǎo)致基數(shù)較低，而且炮制后更容易溶出。

3.4 問題與展望 一般來說，大多數(shù)中藥，都有兩種或兩種以上的功效，適應(yīng)證多，治療范圍廣。如果適當(dāng)配伍另一種藥物，直接或間接地促進(jìn)某一功能的發(fā)揮，或抑制某些不良作用，有利于提高臨床療效［2］，附子與姜類藥材配伍正是體現(xiàn)了傳統(tǒng)的調(diào)控思想。本實(shí)驗(yàn)從配伍前后物質(zhì)基礎(chǔ)的變化進(jìn)行了研究，然而這只是其中一方面，其體內(nèi)代謝過程還不清楚，因此應(yīng)該更進(jìn)一步進(jìn)行藥效學(xué)的深入研究加以完善［15］。

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Component research about Aconiti lateralis Radix prepapata compatible with fresh ginger，dried ginger，sand-fried ginger

YE Qiang， GUO Yi-ping， PENG Chen， GUO Li*
（Chengdu University of TCM，Chendu 611137，China）

Aconiti lateralis Radix prepapata；compatibility；fresh ginger；dried ginger；sand-fried ginger；total alkaloids；ester alkaloids；fingerprint

R283

A

1001-1528（2013）05-1035-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2013.05.042

2013-01-07

十二五支撐計(jì)劃 （2011BAI13B05）；國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 （973，2006CB504705）；四川省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（11ZA066）；成都中醫(yī)藥大學(xué)科學(xué)發(fā)展基金 （ZRYB201115）

葉 強(qiáng) （1974—），男，博士，研究方向：中藥化學(xué)。Tel：13980570716，E-mail：strongyeah@126.com

*通信作者：郭 力 （1964—），男，教授，研究方向：中藥化學(xué)。Tel：13881721018，E-mail：gli64@tom.com