CUL4在局限期小細(xì)胞肺癌中的表達及臨床意義*

劉 蕊 李 慧 任秀寶

泛素（ubiquitin，Ub）-蛋白酶體降解系統(tǒng)廣泛存在于真核細(xì)胞中，是細(xì)胞內(nèi)ATP依賴的非溶酶體蛋白降解系統(tǒng)，由泛素激活酶（E1）、泛素轉(zhuǎn)移酶（E2）和泛素連接酶（E3）共同完成，參與調(diào)控細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的活性，激活或抑制癌基因及抑癌基因的表達，從而直接或間接影響各種惡性腫瘤的發(fā)生。其中只有泛素連接酶識別底物具有特異性，所以目前的研究大多集中在E3上。CUL4家族包含CUL4A和CUL4B兩個成員，因含一個環(huán)指結(jié)構(gòu)域而具有E3的功能。CUL4A在多種腫瘤組織中過表達，其表達增加與不良預(yù)后相關(guān)，而CUL4B基因的突變與人類伴χ染色體的精神發(fā)育遲滯相關(guān)，但CUL4家族與局限期小細(xì)胞肺癌之間的關(guān)系鮮有報道。本研究利用免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察CUL4A、CUL4B在局限期小細(xì)胞肺癌組織芯片中的表達，并分析其與臨床病理特征的關(guān)系，為局限期小細(xì)胞肺癌個體化治療和預(yù)后判斷提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標(biāo)本 收集天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2001年1月至2010年6月間資料完整且經(jīng)病理診斷證實的局限期小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本72例，其中男性48例（吸煙者31例占64.6%），女性24例（吸煙者5例占20.8%），中位年齡57（30～79）歲，以14例距離癌組織5cm以上的癌旁正常組織作為對照。

1.1.2 主要試劑 兔抗CUL4A購自美國BETHYL公司，兔抗CUL4B購自美國Proteintech Group公司，En?vision二步法免疫組織化學(xué)試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.2 方法

1.2.1 組織芯片的構(gòu)建 復(fù)習(xí)所有HE切片，選取代表性的區(qū)域并在蠟塊上做標(biāo)記，用內(nèi)徑為1.5 mm的空心管在每個蠟塊標(biāo)記處穿取組織，在空白蠟塊上打孔（直徑1.5 mm），將穿取的組織蠟塊編號并依次排入空白蠟塊的孔中，對蠟塊進行4um連續(xù)切片，制成微陣列排列的組織芯片。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色 芯片常規(guī)脫蠟水化。在pH 6.0的0.01 mmol/L枸櫞酸鹽緩沖液中高壓抗原修復(fù)，加一抗稀釋液（CUL4A抗體稀釋度為1:200；CUL4B抗體稀釋度為1:100），4℃濕盒孵育過夜，加入二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。

1.2.3 結(jié)果判定 根據(jù)陽性細(xì)胞所占的百分比及陽性細(xì)胞染色強度用半定量免疫評分法來判定實驗結(jié)果。1）染色強度：0分為無著色；1分為淡黃色；2分為棕黃色；3分為棕褐色。2）陽性細(xì)胞所占的百分比：1分為陽性細(xì)胞≤25%；2分為26%～50%；3分為51%～75%；4分為76%～100%。染色強度與陽性細(xì)胞所占百分比的乘積：≤1分為免疫組織化學(xué)染色陰性，以乘積結(jié)果的中位數(shù)為分組點，≤4分為低表達，＞4分為高表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有的統(tǒng)計均選用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗和Fisher精確檢驗。以Kaplan-Meier法進行單因素分析，采用Log rank檢驗比較組間生存時間。應(yīng)用Cox比例風(fēng)險回歸模型進行預(yù)后的多因素分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CUL4在局限期小細(xì)胞肺癌組織中過度表達

CUL4A陽性細(xì)胞著色定位于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃或棕褐色，72例癌組織中有52例陽性表達（72.2%），14例癌旁組織中有5例陽性表達（35.7%），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖1A）。CUL4B陽性細(xì)胞著色定位于細(xì)胞核，72例癌組織中有49例陽性表達（68.1%），14例癌旁組織中有4例陽性表達（28.6%），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖1B）。

圖1 CUL4A和CUL4B在局限期小細(xì)胞肺癌組織和癌旁組織中的表達情況（DAB，×400）Figure 1 CUL4A and CUL4B expression in L-SCLC tissues and pa?ra-cancerous tissues（×400）

2.2 CUL4表達與L-SCLC臨床病理特征的關(guān)系

CUL4A表達水平與患者吸煙情況密切相關(guān)。在吸煙患者中CUL4A高表達者占50.0%（18/36），明顯高于不吸煙患者的22.2%（8/36），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。CUL4B的表達與患者性別、吸煙情況密切相關(guān)（P＜0.05）。在男性患者中CUL4B高表達者占45.8%（22/48），明顯高于女性患者的12.5%（3/24），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。在吸煙患者中CUL4B高表達者占50.0%（18/36），明顯高于不吸煙患者的19.4%（7/36），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

表1 CUL4表達與局限期小細(xì)胞肺癌臨床病理參數(shù)間的關(guān)系Table 1 Association of CUL4 with clinicopathologic characteristics of L-SCLC

2.3 CUL4表達與局限期小細(xì)胞肺癌預(yù)后的關(guān)系

單因素分析發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移、CUL4A表達水平、CUL4B表達水平和血液LDH量均與患者的PFS和OS相關(guān)（表2）。CUL4A低表達組與高表達組相比，中位PFS顯著延長（P＜0.05），中位OS顯著延長（P＜0.05，圖3）。CUL4B低表達組與高表達組相比，中位PFS顯著延長（P＜0.05），中位OS顯著延長（P＜0.05，圖4）。多因素結(jié)果顯示，CUL4B高表達是影響OS的獨立危險因素，而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血液LDH升高不僅是影響OS，也是影響PFS的獨立危險因素（表3）。

表2 局限期小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后影響因素的單因素分析Table 2 Univariate analysis of clinical characteristics and survival in L-SCLC

表2 局限期小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后影響因素的單因素分析（續(xù)表2）Table 2 Univariate analysis of clinical characteristics and survival in L-SCLC

圖3 CUL4A低表達組與高表達組的總生存曲線Figure 3 OS curve of low CUL4A expression group and high CUL4A ex?pression group

圖4 CUL4B低表達組與高表達組的總生存曲線Figure 4 OS curve of low CUL4B expression group and high CUL4B ex?pression group

表3 局限期小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后影響因素的多因素分析Table 3 Multivariate analysis of clinical characteristics and survival in L-SCLC

3 討論

目前認(rèn)為，真核細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)主要通過兩種不同的蛋白酶解系統(tǒng)降解，溶酶體途徑和泛素-蛋白酶途徑。其中，約80%通過泛素-蛋白酶體途徑降解。泛素連接酶是泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的重要成分，其在癌形成過程中扮演著重要的角色［1］。CUL4是最新發(fā)現(xiàn)的一種泛素連接酶，CUL4家族包括結(jié)構(gòu)和功能極具同源性的CUL4A和CUL4B兩個成員。大量研究表明，CUL4A的異常表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。CUL4A基因過表達最早發(fā)現(xiàn)于原發(fā)性乳腺癌中［2］，全基因組分析顯示，5%的家族性乳腺癌和20%的三陰乳腺癌中檢測到CUL4A基因過表達［3］。另外，原發(fā)性惡性胸膜間皮瘤［4］、卵巢癌［5］中也發(fā)現(xiàn)CUL4A基因過表達。體內(nèi)研究進一步證實，CUL4A敲除的小鼠與野生型小鼠相比，能夠顯著抵御UV介導(dǎo)的皮膚癌的發(fā)生［6］。研究證實，CUL4B基因突變與人類伴×染色體的精神發(fā)育遲滯相關(guān)［7］，而CUL4B在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用鮮有報道。

本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測CUL4A、CUL4B在局限期小細(xì)胞肺癌和癌旁正常組織中的表達水平。結(jié)果顯示：CUL4A和CUL4B在癌組織中的陽性率均明顯高于癌旁正常組織，表明CUL4A、CUL4B基因的表達增高可促使腫瘤的發(fā)生。

分析局限期小細(xì)胞肺癌組織中CUL4A、CUL4B蛋白表達與臨床病理特征關(guān)系，顯示CUL4A表達水平與吸煙情況密切相關(guān)。CUL4B的表達與性別、吸煙情況密切相關(guān)。流行病學(xué)研究證實，煙草中的多環(huán)芳烴及亞硝胺類等致癌物可導(dǎo)致Ras、p53、Rb等基因點突變及C-Met基因構(gòu)成型激活等分子異常，進而導(dǎo)致肺癌的發(fā)生［8］。CUL4家族高表達與患者吸煙情況密切相關(guān)，提示其可能與煙草中的致癌物在小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展中具有緊密聯(lián)系。CUL4家族與吸煙導(dǎo)致肺癌的通路研究有待深入。而CUL4B在男性患者中顯著高表達可能與本研究中男性吸煙患者比例高于女性（64.6%vs.28.8%）有關(guān)。

另外，本研究對CUL4表達與局限期小細(xì)胞肺癌預(yù)后關(guān)系的單因素分析結(jié)果顯示，淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移、CUL4A表達水平、CUL4B表達水平和血液LDH量均與患者的PFS和OS相關(guān)。CUL4A、CUL4B低表達組與高表達組相比，中位PFS和中位OS均顯著延長。多因素結(jié)果顯示，CUL4B高表達是影響OS的獨立危險因素，而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血液LDH升高不僅是影響OS，也是影響PFS的獨立危險因素。目前認(rèn)為，LDH升高與腫瘤負(fù)荷呈正相關(guān)。本研究顯示LDH升高不僅是影響OS，也是影響PFS的獨立危險因素，是小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后不良的重要因素之一，與李勇等［9］的報道一致，而高表達CUL4家族的患者無進展生存期和總生存期顯著縮短，也與Schindl等［10］在乳腺癌患者中觀察的結(jié)果相符。

研究證實CUL4可降解細(xì)胞周期抑制蛋白P21、P27［11-12］；CUL4 也參與細(xì)胞凋亡蛋白 P53降解［13］；另外，CUL4可降解一系列腫瘤抑制蛋白，如Merlin蛋白［14］，mTOR通路抑制因子REDD1［15］等。表明CLU4 可通過參與調(diào)控細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的活性，激活或抑制癌基因及抑癌基因的表達，從而直接或間接影響各種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。CUL4家族在局限期小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用和分子機制需通過分子生物學(xué)實驗進一步研究證實。

綜上所述，CUL4家族在局限期小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。其與患者的吸煙情況及預(yù)后密切相關(guān)，可以作為預(yù)測局限期小細(xì)胞肺癌術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的分子標(biāo)記物，并為局限期小細(xì)胞肺癌的靶向治療提供依據(jù)。

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