EHD2負向調(diào)控前列腺癌細胞的增殖與轉(zhuǎn)化能力*

李 盼 龔玉愛 許世磊 陳永孜 田 剛 姚 欣 應國光

前列腺癌全球每年新發(fā)病例約90萬例，發(fā)病率居男性惡性腫瘤第二位；尤其在發(fā)展中國家前列腺癌死亡率高達47%［1］。近十年，我國前列腺癌發(fā)病率的增長極為迅速，成為嚴重威脅男性生命健康的惡性腫瘤之一。

EHD2（C-Terminal EH Domain Containing Protein 2，EHD2）是最近發(fā)現(xiàn)的一種新型的膜轉(zhuǎn)運調(diào)控蛋白，是EH蛋白家族中EHD亞類4個成員（EHD1、EHD2、EHD3、EHD4）之一，其C端含有一蛋白相互作用EH域。目前認為EHD2參與多種受體的轉(zhuǎn)運調(diào)控，如類胰島素生長因子受體［2］、胰島素調(diào)節(jié)的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白［3］和神經(jīng)生長因子受體［4］等。EHD2蛋白在乳腺腫瘤和食管鱗癌中低表達［5-7］，EHD2表達降低可能影響了上皮細胞的極性［8］，但在其它腫瘤中是否具有普遍意義尚不明確，而且EHD2對細胞增殖與轉(zhuǎn)化特性的影響也未見報道。

本研究使用免疫組織化學方法檢測EHD2蛋白在前列腺癌組織中的表達，同時通過小RNA干擾技術沉默或過表達EHD2后，檢測EHD2蛋白對前列腺癌DU145細胞生長與轉(zhuǎn)化特性的影響，為闡明前列腺癌發(fā)生機制和尋找治療前列腺癌的新途徑、新靶點提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標本 14例前列腺癌組織標本和7例前列腺增生組織標本都來自天津醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院手術切除或穿刺的前列腺癌男性患者，病理分級以Gleanson分級為依據(jù)。

1.1.2 細胞培養(yǎng)與主要試劑 293T細胞由本實驗室保存，前列腺癌DU145細胞系由天津市南開大學分子生物學研究室贈送，由本實驗室保存。293T細胞和DU145細胞分別生長于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液和RPMI 1640培養(yǎng)液，置于5%CO2、飽和濕度、37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（Hyclone公司），青/鏈霉素（Amersco公司），0.25%胰蛋白酶（GIBCO公司），二甲基亞砜DMSO、PMSF（Sig?ma公司），β-巰基乙醇（Boehinger公司），ECL化學發(fā)光、PVDF膜（Millipore公司），BCA蛋白定量試劑盒（Pierce公司），質(zhì)粒小提試劑盒（天根公司），EHD2抗體（本實驗室制備），GAPDH抗體（Santa Cruz公司），二抗（中衫公司）。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學 所有標本為首先用10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片進行免疫組織化學染色檢測。結果判定：EHD2表達以細胞質(zhì)或細胞核中出現(xiàn)棕黃或棕褐色顆粒為陽性判斷標準。每例鏡下隨機觀察5個高倍視野（×400）。EHD2在胞質(zhì)和胞核表達情況采用免疫反應評分進行半定量分析。根據(jù)陽性細胞數(shù)的百分率分為4個等級：0%為0分，1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～100%為3分；細胞染色強度分4個等級：無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將每張切片染色程度與染色細胞百分率得分相乘的積為最后得分，0～1分為（-），2～3分為弱陽性（+），4～6分為中等陽性（++），＞6分為強陽性（+++），認定前1個等級為陰性表達，后3個等級為陽性表達。

1.2.2 EHD2干擾表達和過表達細胞系的建立 慢病毒表達質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒經(jīng)磷酸鈣法共轉(zhuǎn)染293T細胞，48h后收集含有病毒的上清，用全培養(yǎng)液稀釋后感染處于對數(shù)生長期的DU145細胞，并用500ng/mL的嘌呤霉素（Puromycin）進行篩選建系。

1.2.3 Western blot檢測 SDS裂解液提取細胞總蛋白后，用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度，等量蛋白進行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳。采用增強化學發(fā)光試劑檢測蛋白條帶信號，Kodak膠片曝光。用ImageJ 1.43軟件對條帶進行定量。

1.2.4 細胞計數(shù)法檢測細胞增殖 將相同細胞數(shù)（2.0×104個細胞）的各組細胞分別種入12孔盤中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)，記為第0d，從第2d開始，每24 h分別將每組細胞的一個孔中細胞消化收集，細胞計數(shù)，連續(xù)計數(shù)4d，實驗重復3次，繪制細胞增殖曲線。

1.2.5 檢測細胞二維克隆形成能力 將相同細胞數(shù)（4.0×103個細胞）的各組細胞分別種入6 cm dish（每組3個重復孔），37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)。長出明顯克隆時，棄培養(yǎng)液，PBS清洗2遍。甲醇固定，PBS清洗，結晶紫染色。用倒置顯微鏡，×100光鏡下分別計數(shù)＞50個細胞的克隆數(shù)、10～50個細胞的克隆數(shù)、2～10個細胞的克隆數(shù)，5個視野/培養(yǎng)皿，實驗重復3次，統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

1.2.6 Soft Agar檢測細胞懸浮克隆形成能力 配制0.7%和1.2%的瓊脂糖上層膠和下層膠，高壓滅菌后于室溫降至50～60℃時放入42℃水浴。配制2倍RPMI 1640培養(yǎng)基（含200 U/mL青霉素、200 μg/mL鏈霉素及20%FBS）。取等體積的2×RPMI 1640和1.2%的Agarose，充分混勻，向35 mm dish中加入1.5 mL，并傾斜盤子使其均勻鋪于孔底，室溫固化。細胞消化計數(shù)后，取等體積的2×RPMI 1640和0.7%的瓊脂糖，加入所需細胞數(shù)，充分混勻，加入已經(jīng)固化的下層膠，1 mL/35 mm dish。37℃孵箱培養(yǎng)10～14d后，待長出明顯克隆后，每盤加入0.5 mL的0.005%的結晶紫1 h以上染色?！?0光鏡下計＞0.05 mm的克隆數(shù)，共計10個視野。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 免疫組化結果

采用免疫組織化學的方法檢測EHD2在14例前列腺癌組織和7例前列腺增生組織中的表達水平，結果發(fā)現(xiàn)與前列腺增生組織相比，EHD2在前列腺癌組織中的表達普遍降低（圖1）。7例前列腺增生組織中只有1例（14.0%）EHD2陰性，其余均為陽性，而14例前列腺癌組織中9例（64.5%）EHD2呈陰性（表1）。

2.2 DU145細胞EHD2干擾和過表達細胞系的建立

采用慢病毒質(zhì)粒構建EHD2干擾和過表達體系，感染前列腺癌細胞DU145后用500ng/mL嘌呤霉素（Puromycin）篩選并建立穩(wěn)定細胞系，免疫印跡檢測EHD2的干擾沉默和過表達情況。結果顯示EHD2的干擾和過表達效果明顯（圖2）。

圖1 EHD2在前列腺癌組織和前列腺增生組織中的IHC染色典型表現(xiàn)（DAB×400）Figure 1 Representative immunohistochemistry images of EHD2 stain?ing in prostate cancer tissue and benign prostatic hyperplasia DAB×400

表1 EHD2在前列腺癌組織和前列腺增生組織中的表達情況 例（%）Table 1 EHD2 expression level in prostate cancer tissue and benign prostatic hyperplasia Case（%）

圖2 免疫印跡檢測在DU145細胞中EHD2干擾和過表達效果Figure 2 Western blot analysis of the silencing and overexpression ef?fects of EHD2 in DU145 cells

2.3 細胞計數(shù)檢測細胞增殖能力

采用細胞計數(shù)的方法連續(xù)觀察EHD2干擾和過表達細胞的增殖能力。結果顯示，EHD2干擾后DU145細胞增殖加快，EHD2過表達后DU145細胞生長減慢（圖3），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

2.4 EHD2干擾后細胞二維克隆形成能力檢測

采用細胞二維克隆培養(yǎng)的方法，研究EHD2沉默對DU145細胞克隆形成能力的影響。結果顯示EHD2干擾后DU145細胞克隆形成數(shù)量和克隆大小明顯大于對照細胞（圖4），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

2.5 細胞轉(zhuǎn)化特性檢測

采用Soft Agar實驗，研究EHD2沉默或過表達對DU145細胞懸浮生長能力的影響。結果顯示，EHD2干擾后，DU145懸浮克隆形成能力增強（圖5A），兩組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；EHD2過表達后克隆形成能力減弱（圖5B），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖3 EHD2的表達水平對DU145細胞增殖能力的影響Figure 3 Effects of EHD2 expression on DU145 proliferation

圖4 EHD2干擾對DU145細胞二維克隆形成能力的影響Figure 4 Effects of EHD2 silencing on DU145 colony formation

圖5 EHD2表達水平對DU145細胞三維克隆形成能力的影響Figure 5 Effects of EHD2 expression on DU145 colony formation in soft agar

3 討論

本研究前期通過腫瘤基因組轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)挖掘分析發(fā)現(xiàn)EHD2在乳腺腫瘤中表達缺失，而且其表達水平和病理分級呈負相關性［5］，免疫印跡結果顯示EHD2在侵潤性乳腺癌中表達水平明顯低于乳腺正常組織［6］，從而首次在蛋白水平驗證了EHD2與腫瘤的關系。近期有報道在食管鱗癌組織中EHD2的表達水平和病理分級呈負相關，EHD2在轉(zhuǎn)移性食管鱗癌中低表達，并且在干擾表達后細胞對順鉑引起的凋亡產(chǎn)生抵抗［7］。另外在基因轉(zhuǎn)錄水平，與正常卵巢上皮樣本相比，也發(fā)現(xiàn)EHD2在惡性漿液性卵巢癌中呈低表達［9］。EHD2并可能是神經(jīng)膠質(zhì)瘤缺失染色體1.6Mb 19q區(qū)一個可能的抑癌基因［10］。本研究應用免疫組織化學的方法發(fā)現(xiàn)EHD2在前列腺癌組織中的表達量明顯低于前列腺增生組織，說明EHD2的低表達同樣可能與前列腺癌的形成有關。

細胞無限增殖是惡性腫瘤形成的重要標志之一。本文采用細胞計數(shù)法對EHD2干擾和過表達的DU145細胞進行增殖能力檢測，結果顯示EHD2沉默后DU145細胞生長明顯加快，而過表達EHD2后DU145細胞生長則受到抑制，表明EHD2的表達水平影響DU145細胞的增殖，并且在二維克隆實驗中得到一致的結果，表明EHD2的表達缺失促進了細胞的增殖能力。

EHD2是一個新型膜轉(zhuǎn)運調(diào)控蛋白，Benjamin等［11］研究發(fā)現(xiàn)EHD2與Nek3相互作用，并與Vav1形成復合物，共同調(diào)節(jié)Rac1的活性。Rac1是細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導與極性調(diào)控分子，它通過GTPase酶的活性調(diào)控及細胞骨架重排參與調(diào)節(jié)細胞的極性保持與細胞遷移等重要細胞生物學功能。本文前期研究發(fā)現(xiàn)EHD2沉默后上皮細胞呈現(xiàn)極性的喪失［8］，這可能反映了EHD2對Rac1的活性調(diào)控，并可能影響上皮細胞極性并向間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchynal transi?tion，EMT）過程以上皮細胞失去E-cadherin及細胞連接為主要特征，并且與腫瘤細胞的原位侵襲和遠處轉(zhuǎn)移有著密切關系［12］。本文在二維克隆實驗中，發(fā)現(xiàn)EHD2降表達細胞克隆中細胞間的連接與對照相比明顯呈現(xiàn)松散趨勢，與EMT表型類似。Soft Agar實驗發(fā)現(xiàn)EHD2沉默后DU145細胞的懸浮克隆數(shù)明顯增加，而過表達EHD2后的結果則相反，表明EHD2表達水平可以影響腫瘤細胞的轉(zhuǎn)化特性，并且提示在前列腺癌中EHD2表達缺失很可能是促進前列腺癌細胞EMT和惡性轉(zhuǎn)化的重要因素，這與食管鱗癌中EHD2低表達組織中E-cadherin表達同時降低相吻合［7］。因此，EHD2可能通過調(diào)控細胞的E-cadherin和EMT來影響腫瘤的發(fā)生以及侵襲和轉(zhuǎn)移。

膜轉(zhuǎn)運蛋白參與調(diào)控多種膜蛋白與受體的內(nèi)吞轉(zhuǎn)運以及下游信號通路，它們的功能異變涉及腫瘤發(fā)生與進展的多個層面［13-15］。

EHD2在多種腫瘤中的低表達預示其可能是一個新的抑癌基因。在食管鱗癌中EHD2低表達和腫瘤淋巴結轉(zhuǎn)移密切相關，EHD2表達水平越低，淋巴結轉(zhuǎn)移越強，提示EHD2低表達是腫瘤高惡性度的分子指標，而且EHD2低表達患者的生存情況明顯差于EHD2高表達患者，表明腫瘤組織EHD2表達水平的檢測對幫助患者預后判斷可能具有重要的臨床意義。EHD2不僅可能是幫助進行腫瘤惡性度以及臨床預后判斷的一個新的分子指標，還可能是腫瘤研究和治療的重要靶點。

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