多西紫杉醇治療前列腺癌的分子機(jī)制研究*

吳 靜 方克偉 石志豪 陳 韜 董 彪

前列腺癌（prostate carcinoma，Pca）是男性常發(fā)惡性腫瘤。在西方國(guó)家，前列腺癌死亡率居男性惡性腫癌的第二位［1］。近年來(lái)，我國(guó)男性前列腺癌發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)［2］。前列腺癌的發(fā)生經(jīng)歷了雄激素依賴且受雄激素刺激階段，非雄激素依賴但受雄激素刺激階段，非雄激素依賴且雄激素不敏感階段及非雄激素依賴且受雄激素抑制階段等復(fù)雜的過(guò)程。因此，研究雄激素受體在前列腺癌中的表達(dá)是近年的熱點(diǎn)問(wèn)題［3］。圍繞前列腺癌的基因組、基因轉(zhuǎn)錄和蛋白代謝的研究，可能提供集預(yù)測(cè)、治療和預(yù)后于一體的“分子信號(hào)”［4］。紫杉醇是一種存在于紫杉烷類植物樹(shù)皮和枝葉中的二萜烯類物質(zhì)，因其阻礙腫瘤細(xì)胞微管活性，在G2/M期阻礙紡錘體的形成而抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)［5-7］，而多西紫杉醇是一種半合成的紫杉醇衍生物。本研究基于上述認(rèn)識(shí)，以前列腺癌細(xì)胞株LNCaP、PC-3和CWR22-rv1為研究對(duì)象，研究其經(jīng)多西紫杉醇處理后磷酸化c-jun（phosphorylated c-jun，p-c-jun）的變化及與雄激素受體（Androgen Receptor，AR）的相互關(guān)系、p-c-jun及AR與前列腺癌細(xì)胞存活率的關(guān)系，以探討多西紫杉醇治療前列腺癌的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和試劑

雄激素依賴型細(xì)胞株LNCaP和CWR22-rv1、非雄激素依賴的細(xì)胞株P(guān)C-3均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所。脂質(zhì)體2000、c-jun抗體、p-c-jun抗體均購(gòu)自上海圣克魯斯生物技術(shù)公司。AR抗體購(gòu)自北京Upstate生物技術(shù)有限公司，PSA購(gòu)自深圳Dako公司。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗兔和抗鼠抗體均購(gòu)自北京Sigma公司，化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒購(gòu)自上海Amersham公司。AP-1 luc購(gòu)自上海promega公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 雄激素依賴型細(xì)胞株LNCaP和CWR22rv1細(xì)胞、非雄激素依賴的細(xì)胞株P(guān)C-3培養(yǎng)于含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素RP?MI-1640培養(yǎng)基（GIBCO公司）中。37℃下于含5%CO2的條件下常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞以0.25%胰蛋白酶消化傳代，2～3 d傳代1次。將5×106個(gè)/mL細(xì)胞接種于96孔板，每孔200 μL，貼壁生長(zhǎng)后，分別以5 nM濃度紫杉醇處理細(xì)胞24和48 h，每種濃度設(shè)平行重復(fù)7孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，并設(shè)立不加任何藥物的空白對(duì)照組。

1.2.2 細(xì)胞存活率 細(xì)胞存活率用臺(tái)酚藍(lán)排除法直接觀察。細(xì)胞接種在24孔版中，每孔接種細(xì)胞為2.5×104個(gè)。24 h后，細(xì)胞經(jīng)5 nM的Doc處理24或48h。等量細(xì)胞沉淀和0.4%臺(tái)盼藍(lán)與磷酸鹽緩沖液混合，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板來(lái)計(jì)數(shù)活的細(xì)胞數(shù)量。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡分析 細(xì)胞裂解后，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。電泳時(shí)，30μg全細(xì)胞裂解液用4%～12%SDS-PAGE分離，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。置于含5%無(wú)脂肪的TBST緩沖液中，室溫封閉1h。然后在封閉袋中加入鼠抗人c-Jun一抗（1:1 000）過(guò)夜孵育。隔日洗膜，加入辣根過(guò)氧化物酶酶標(biāo)的羊抗鼠二抗（1:5 000）的封閉液，37℃振搖保溫1～2h。洗膜后，使用ECL試劑發(fā)光、顯影、定影。為了確保上樣量一致，用β-actin作為對(duì)照。蛋白質(zhì)印跡分離得到的蛋白質(zhì)條帶的密度用Bio-Rad Quality one-4.6.2凝膠成像儀分析完成。

1.2.4 細(xì)胞免疫熒光 細(xì)胞接種在4孔的細(xì)胞培養(yǎng)玻片中，分別以正常條件及暴露在5 nM Doc中培養(yǎng)48h。細(xì)胞用2%多聚甲醛固定10min，室溫下用含0.1%Triton X-100的PBS處理15min，用含10%驢血清的PBS封閉30min，然后用單克隆p-c-jun一抗在4°C孵育過(guò)夜。隔日用Alexa 488染色1 h。陰性對(duì)照反應(yīng)不加一抗。在奧林巴斯AX70顯微鏡和Nikon DS-U1數(shù)碼彩色相機(jī)下觀察細(xì)胞。

1.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前24 h前列腺癌細(xì)胞（3×105個(gè)細(xì)胞/mL）接種到含10%熱滅活胎牛血清RPMI的12孔培養(yǎng)板中。脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染AR及c-jun。用AP-1 luc作為AP-1的示蹤劑。孵育24 h后，加或不加Doc（5 nM）、雙氫睪酮（DHT）（10 nM）或100 nM的12-O-十四烷酰佛波-13醋酸酯（TPA）（作為p-c-jun的化學(xué)誘導(dǎo)劑），繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收獲細(xì)胞并裂解，進(jìn)行熒光素酶活性分析。

1.2.6 實(shí)時(shí)定量PCR 細(xì)胞總的RNAs從經(jīng)過(guò)Doc、二甲基亞砜治療0、3和8d后的LINCaP、PC-3和CWR22-rv1細(xì)胞中抽提出來(lái)。前列腺細(xì)胞使用RNAeasy試劑盒（Promega公司），根據(jù)試劑盒的方法進(jìn)行cDNA的制備、實(shí)時(shí)定量PCR（RT-PCR）。PSA引物序列：5'-AGGCCTT CCCTGTACACCAA-3'/5'-GTCTTGGCCTGGTCATTTC C-3'，AR引物序列為：5'-GTACCTGTCAGCCCCTGAA C-3'/5'-GGAGAGCTGCTTTCGCTTAG-3'，GAPDH引物序列為：5-CGA CCA CTT TGT CAA GCT CA-3/5-AGG GGT CTA CAT GGC AAC TG-3。PCR反應(yīng)條件：95℃10 min，94℃ 1min，57℃ 1 min，72℃ 1 min，循環(huán)35次，72℃延伸10 min。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所得結(jié)果至少來(lái)自3次平行實(shí)驗(yàn)，用SPSS 11.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用表示，P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Doc處理后p-c-jun的表達(dá)及細(xì)胞的存活率

結(jié)果表明Doc（5 nM）處理2 h后就可以誘導(dǎo)p-c-jun的表達(dá)，8h達(dá)到高峰。p-c-jun在CW22-rv1細(xì)胞系表達(dá)最高，LNCaP細(xì)胞系次之，PC-3細(xì)胞系表達(dá)最低（圖1）。細(xì)胞免疫熒光分析也顯示PC-3細(xì)胞的p-c-jun染色比LNCaP和CW22rv1細(xì)胞弱。細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)顯示，Doc處理細(xì)胞后，CWR22-rv1的細(xì)胞存活率為40%，LNCaP細(xì)胞的細(xì)胞存活率為30%，PC-3細(xì)胞存活率為10%（圖2）。結(jié)果提示p-c-jun蛋白的表達(dá)水平與細(xì)胞生存密切相關(guān)。轉(zhuǎn)染了c-jun基因到PC-3細(xì)胞后，該細(xì)胞對(duì)多西紫杉醇的敏感性下降，細(xì)胞存活率上升為40%。共轉(zhuǎn)染c-jun和AR基因，PC-3細(xì)胞對(duì)多西紫杉醇中度敏感，細(xì)胞存活率為30%（圖3）。

圖1 三種前列腺癌細(xì)胞暴露于5 nM Doc培養(yǎng)0～30 dFigure 1 PC-3，CW22-rv1，and LNCaP cell lines treated with 5 nM Doc for 0 d to 30 d

圖2 三種細(xì)胞暴露于5 nM Doc培養(yǎng)24、48 h后存活率Figure 2 Percentage of viable cells in PC-3，CW22-rv1，and LNCaP af?ter exposure to 5 nM Doc for 24 and 48 h

圖3 PC-3細(xì)胞轉(zhuǎn)染c-jun和AR基因后對(duì)Doc的敏感性Figure 3 Sensitivity to Doc in PC-3 cells transfected with c-jun and AR

圖4 LNCaP-bic及LNCaP細(xì)胞暴露于多西紫杉醇（Doc，5 nM），雙氫睪酮（DHT，10 nM）或比卡魯胺（cas，10μM）24 h后PSA、AR表達(dá)的變化Figure 4 Expression of PSA and AR in LNCaP-bic and LNCaP cells af?ter exposure to Doc（5 nM），DHT（10 nM），or cas（10 μM）for 24 h，as well as cells without Doc treatment（0 h）

2.2 Doc對(duì)LNCaP-bic的效應(yīng)

LNCaP-bic是從含有1 μM比卡魯胺培養(yǎng)液中培養(yǎng)9個(gè)月的LNCaP細(xì)胞中分離出來(lái)的細(xì)胞，與LNCaP細(xì)胞比較，LNCaP-bic經(jīng)Doc處理后，其PSA蛋白水平顯著增加，而AR蛋白表達(dá)水平卻低（圖4）。細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)表明，LNCaP-bic對(duì)Doc低度敏感，存活率為40%，與CW22-rv1對(duì)Doc的治療反應(yīng)類似（圖5）。與父代LNCaP細(xì)胞相比，LNCaP-bic暴露于Doc后有著高水平的p-c-jun及抗凋亡能力。

2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和PCR結(jié)果

PSA和ARE轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞LNCaP和LN?CaP-bic后，對(duì)Doc的反應(yīng)活性增加，雙氫睪酮單獨(dú)治療或與Doc聯(lián)合治療誘導(dǎo)了AR和PSA的反應(yīng)活性升高。AP-1轉(zhuǎn)染LNCaP和LNCaP-bic細(xì)胞后暴露于Doc、TPA、DHT或者DHT聯(lián)合Doc的培養(yǎng)液中，發(fā)現(xiàn)雙氫睪酮治療后，LNCaP細(xì)胞的AP-1轉(zhuǎn)錄活性受抑制，但LNCaP-bic細(xì)胞更明顯，Doc治療后則表現(xiàn)為中度的轉(zhuǎn)錄活性。DHT聯(lián)合Doc治療后，引起LNCaP細(xì)胞的AP-1轉(zhuǎn)錄活性中度升高、LNCaP-bic細(xì)胞的AP-1轉(zhuǎn)錄活性明顯升高。LNCaP和LNCaP-bic細(xì)胞經(jīng)TPA處理后AP-1的轉(zhuǎn)錄活性均升高（圖6）。實(shí)時(shí)定量PCR顯示Doc治療LNCaP細(xì)胞后第8d AR蛋白水平顯著降低，卻引起了AR的mRNA增加（圖7）。

圖5 四種細(xì)胞暴露于5 nM Doc培養(yǎng)24、48h后的細(xì)胞存活率Figure 5 Percentage of viable cells in PC-3，CW22-rv1，LNCaP，and LNCaP-bic cells after exposure to 5 nM Doc for 24 and 48 h

圖6 AP-1轉(zhuǎn)染LNCaP和LNCaP-bic細(xì)胞后，不同處理對(duì)AP-1的轉(zhuǎn)錄活性的影響Figure 6 Transcriptional activity of AP-1 after transfection with AP-1-luc and treatment with 5 nM Doc，10 nM DHT，or 10 nM TPA

圖7 Doc處理LNCaP細(xì)胞后AR蛋白水平顯著降低，但AR mRNA表達(dá)增加（RT-PCR）Figure 7 Decreased expression of AR proteins in LNCaP cells after expo?sure to Doc；however，the relative mean AR mRNA expression was in?creased（measured by quantitative RT-PCR）

3 討論

多數(shù)患者在內(nèi)分泌治療開(kāi)始后的18個(gè)月左右進(jìn)展為激素抵抗性前列腺癌（castration-resistant pros?tate cancer，CRPC），美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)及最近研究確立了多烯紫杉醇（docetaxel，taxotere，Doc）作為HRPC治療的核心地位［6-7］，已作為CRPC的一線化學(xué)治療方案，并得到美國(guó)FDA的批準(zhǔn)［8-9］，但分子機(jī)制尚不清楚。

目前，在前列腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中多條信號(hào)通路表達(dá)異常，如高遷移率族蛋白1（HMGB1）基因［10］、二肽基肽酶（DDPⅣ）［11］、即刻早期基因（immediate early genes，IEGs）等［12］，其中即刻早期基因組原癌基因，包括c-fos、c-jun以及c-myc等，其過(guò)度表達(dá)會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞惡性增殖且侵襲能力增強(qiáng)。作為原癌基金，c-Jun的活化總是與腫瘤細(xì)胞的惡性增殖有關(guān)［8］。由于磷酸化的c-jun即p-c-jun才具有活性，故本研究關(guān)注p-c-jun。

本實(shí)驗(yàn)中分別以雄激素依賴型細(xì)胞株LNCaP和CWR22-rv1、非雄激素依賴的細(xì)胞株P(guān)C-3作為研究對(duì)象，Doc處理后，發(fā)現(xiàn)非雄激素依賴的細(xì)胞株P(guān)C-3的敏感性最高，細(xì)胞的存活率為10%，但p-c-jun最低；雄激素依賴型細(xì)胞株LNCaP和CWR22-rv1分別為30%和40%，p-c-jun的表達(dá)在LNCaP細(xì)胞系次之、CW22-rv1細(xì)胞系最高。免疫熒光分析顯示PC-3細(xì)胞對(duì)應(yīng)的印跡比LNCaP和CW22rv1細(xì)胞相比要弱。轉(zhuǎn)染了c-jun基因到PC-3細(xì)胞后，該細(xì)胞對(duì)多烯紫杉醇的敏感性下降，細(xì)胞存活率上升為40%。共轉(zhuǎn)染c-jun和AR基因，PC-3細(xì)胞對(duì)多烯紫杉醇中度敏感，細(xì)胞存活率為30%。延長(zhǎng)暴露在Doc中的時(shí)間至15 d，p-c-jun維持在一個(gè)比較高的水平。LN?CaP-bic的實(shí)驗(yàn)也顯示LNCaP-bic暴露于Doc后有著高水平的p-c-jun及抗凋亡能力。結(jié)果表明p-c-jun蛋白的表達(dá)水平與細(xì)胞生存密切相關(guān)，而轉(zhuǎn)錄因子p-c-jun表達(dá)水平與細(xì)胞對(duì)Doc的敏感性呈負(fù)相關(guān)。

雄激素受體（androgen receptor，AR）作為雄激素功能的介導(dǎo)者，其突變、異常擴(kuò)增、表達(dá)的異質(zhì)性與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展、惡化密切相關(guān)，抑制AR的表達(dá)和功能便成為治療前列腺癌的有效方法之一。已有的前列腺癌細(xì)胞系，如PC-3細(xì)胞、CW22-rv1細(xì)胞等均能夠在激素剝奪的環(huán)境下生長(zhǎng)［13］。目前僅有LNCaP細(xì)胞系保留了人前列腺癌的激素依賴性的特征，能夠分泌PSA、PSMA及雄激素受體，能夠在具有雄激素樣活性的甾體激素的刺激下生長(zhǎng)。

LNCaP細(xì)胞系依次進(jìn)行多西紫杉醇（Doc，5 nM），雙氫睪酮（DHT，10 nM）或比卡魯胺（bic，10 μM）24h或未經(jīng)處理，結(jié)果表明AR的表達(dá)在DHT處理后較未經(jīng)處理增加，其他情況下是降低的，相應(yīng)的PSA也有同樣改變。進(jìn)一步對(duì)LNCaP-bic進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，與LNCaP細(xì)胞比較，LNCaP-bic經(jīng)Doc處理后，其PSA蛋白水平顯著增加，而AR蛋白表達(dá)水平卻降低，細(xì)胞存活試驗(yàn)表明，LNCaP-bic對(duì)Doc低度敏感，成活率為40%，與CW22-rv1對(duì)Doc的治療反應(yīng)類似。這證明AR的表達(dá)與LNCaP細(xì)胞對(duì)Doc的反應(yīng)正相關(guān)，AR可能是Doc有效治療的關(guān)鍵分子靶點(diǎn)。

為進(jìn)一步明確AR的表達(dá)、作用及其機(jī)制，用PSA和AR轉(zhuǎn)染LNCaP和LNCaP-bic細(xì)胞，結(jié)果顯示二者對(duì)Doc的反應(yīng)活性均增加，雙氫睪酮單獨(dú)治療或與Doc聯(lián)合治療誘導(dǎo)了AR和PSA的升高。AP-1轉(zhuǎn)染LNCaP和LNCaP-bic細(xì)胞后暴露于Doc、TPA、DHT或DHT聯(lián)合Doc，結(jié)果表明DHT治療后，LNCaP細(xì)胞的AP-1轉(zhuǎn)錄活性受抑制，但LNCaP-bic細(xì)胞更明顯；Doc治療后則表現(xiàn)為中度的轉(zhuǎn)錄活性。DHT聯(lián)合Doc治療后，引起LNCaP細(xì)胞的AP-1轉(zhuǎn)錄活性中度升高、LNCaP-bic細(xì)胞的AP-1轉(zhuǎn)錄活性明顯升高。LN?CaP和LNCaP-bic細(xì)胞經(jīng)TPA處理后AP-1的轉(zhuǎn)錄活性均升高。實(shí)時(shí)定量PCR顯示Doc處理LNCaP細(xì)胞后第8天AR蛋白水平顯著降低，卻引起了AR的mRNA增加（圖3）。進(jìn)一步證實(shí)AR的表達(dá)與前列腺癌細(xì)胞對(duì)Doc的治療敏感性正相關(guān)，也說(shuō)明AR的表達(dá)對(duì)p-c-jun是負(fù)向調(diào)節(jié)的。

本研究中熒光素酶實(shí)驗(yàn)顯示AR和c-jun磷酸化間有直接相關(guān)性。PC-3細(xì)胞是雄激素非依賴性細(xì)胞，不表達(dá)AR，對(duì)Doc最敏感。轉(zhuǎn)染了c-jun基因后，該細(xì)胞對(duì)多烯紫杉醇的敏感性下降，細(xì)胞存活率由10%上升為40%。共轉(zhuǎn)染c-jun和AR基因，PC-3細(xì)胞對(duì)多烯紫杉醇中度敏感，細(xì)胞存活率為30%。延長(zhǎng)暴露在Doc中的時(shí)間至15天，p-c-jun維持在一個(gè)比較高的水平。這說(shuō)明雖然AR誘導(dǎo)p-c-jun維持一個(gè)較高的水平，但降低了p-c-jun對(duì)細(xì)胞的保護(hù)性作用，提高了對(duì)Doc的治療反應(yīng)。另外，LNCaP作為激素依賴性細(xì)胞，表達(dá)AR。實(shí)驗(yàn)顯示，Doc治療后p-c-jun會(huì)引起LNCaP細(xì)胞的保護(hù)性反應(yīng)，有研究認(rèn)為其機(jī)制是NF-КB［14］。而LNCaP-bic細(xì)胞實(shí)驗(yàn)卻顯示長(zhǎng)期缺乏、切除雄激素可以增加AR活性，而AR蛋白水平是降低的。

為進(jìn)一步明確p-c-jun與AR的相互關(guān)系及作用進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。用PSA和AR轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞LNCaP和LNCaP-bic后，二者對(duì)Doc的反應(yīng)活性均增加。AP-1轉(zhuǎn)染LNCaP和LNCaP-bic細(xì)胞后，經(jīng)DHT刺激，LNCaP細(xì)胞的AP-1轉(zhuǎn)錄活性受抑制，但LNCaP-bic細(xì)胞更明顯，AR的表達(dá)降低；Doc處理后則表現(xiàn)為中度的轉(zhuǎn)錄活性，AR的表達(dá)中度升高。DHT聯(lián)合Doc處理后，LNCaP細(xì)胞的AP-1轉(zhuǎn)錄活性中度升高、LNCaP-bic細(xì)胞的AP-1轉(zhuǎn)錄活性明顯升高。作為p-c-jun的誘導(dǎo)劑，TPA處理LNCaP和LN?CaP-bic細(xì)胞后AP-1的轉(zhuǎn)錄活性均升高。實(shí)時(shí)定量PCR顯示Doc處理LNCaP細(xì)胞后第8天AR蛋白水平顯著降低，卻引起了AR的mRNA增加。上述結(jié)果表明p-c-jun是LNCaP對(duì)Doc的保護(hù)性因子，而AR與p-c-jun是相互影響的，AR對(duì)p-c-jun有負(fù)向調(diào)節(jié)的作用，AR受DHT的調(diào)節(jié)，與已有報(bào)道結(jié)論類似［15］。其機(jī)制可能是c-Jun對(duì)轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控是通過(guò)c-jun基因編碼核苷酸切除修復(fù)體系中的特殊成分，在轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)的DNA修復(fù)中起作用，以保護(hù)細(xì)胞免受細(xì)胞毒物影響［16］。

前列腺癌的發(fā)病率不斷上升，其治療有許多難題，尤其對(duì)CRPC的治療，仍無(wú)理想的方案。本研究通過(guò)對(duì)前列腺癌細(xì)胞株LNCaP、PC-3和CW22-rv1經(jīng)Doc處理后細(xì)胞株的生存情況、AR及p-c-jun的表達(dá)情況及其與細(xì)胞生存的關(guān)系研究，發(fā)現(xiàn)p-c-jun降低了前列腺癌細(xì)胞株對(duì)多西紫杉醇的反應(yīng)，而AR可以增加前列腺癌細(xì)胞株對(duì)多西紫杉醇的反應(yīng)，AR上調(diào)抑制c-jun/p-c-jun的轉(zhuǎn)錄活性以降低前列腺癌對(duì)Doc的抵抗性可能是Doc治療前列腺癌的機(jī)制之一，通過(guò)雄激素對(duì)AR表達(dá)的調(diào)節(jié)，有望成為今后治療CRPC的方向。

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