抗CD47單克隆抗體對(duì)卵巢癌細(xì)胞靶向治療的體外研究*

鞠寶輝 黃宇婷 田 菁 馮 慧 胡林萍 袁衛(wèi)平 郝 權(quán)

卵巢癌是女性生殖器官常見(jiàn)的腫瘤之一，其發(fā)病率居第3位，但死亡率卻高居首位。盡管在現(xiàn)有的治療中，經(jīng)過(guò)腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)和化療等治療手段在短期中得到有效緩解，但80%～85%患者會(huì)出現(xiàn)耐藥及復(fù)發(fā)，最終導(dǎo)致臨床治療的失?。?-2］。而其治療的最大障礙是腫瘤細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生，深入研究卵巢癌腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為及發(fā)現(xiàn)新的靶向藥物對(duì)卵巢癌的治療具有重要意義。CD47是抑制性受體信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α（SIRPα）的胞外配體，二者結(jié)合通過(guò)產(chǎn)生抑制性信號(hào)降低巨噬細(xì)胞的吞噬活性，從而產(chǎn)生腫瘤的免疫逃逸。既往在白血病、乳腺癌、膀胱癌、非霍奇金淋巴瘤等惡性腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)CD47呈高表達(dá)狀態(tài)，應(yīng)用抗CD47單克隆抗體能夠特異性的作用于腫瘤細(xì)胞促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬作用。然而，應(yīng)用抗CD47單克隆抗體對(duì)卵巢癌是否具有靶向治療作用目前尚處于初步研究，因此本研究從體外實(shí)驗(yàn)為卵巢癌的靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

收集天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2011年6月至2011年12月手術(shù)切除的卵巢組織標(biāo)本45例，均經(jīng)病理檢查確診，其中卵巢癌組織39例，正常卵巢組織6例。按卵巢癌組織分化程度：高分化8例，中分化8例，低分化23例；按FIGO標(biāo)本臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期7例，Ⅲ～Ⅳ期32例。所有病例經(jīng)患者知情同意，簽署知情同意書(shū)。

昆明品系小鼠、人卵巢癌細(xì)胞系SKOV-3均由天津市腫瘤防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。鼠抗人CD47單克隆抗體、鼠抗人HLA單克隆抗體、鼠IgG1同型對(duì)照抗體（BD Pharmingen，美國(guó)），CFSE（eBioscience，美國(guó)），膠原酶Ⅱ、透明質(zhì)酸酶（Sigma，美國(guó)），紅細(xì)胞裂解液（Stem cell，加拿大），胎牛血清（Hyclone，美國(guó)），DMEM培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)），24孔板（Costar，美國(guó)）。熒光倒置顯微鏡及照相系統(tǒng)（Nikon，日本），流式細(xì)胞儀（BD ARIRⅡ，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞獲得/培養(yǎng) 人卵巢組織細(xì)胞的獲得：臨床手術(shù)取得的正常卵巢組織和卵巢癌組織于超凈臺(tái)中，將組織剪成碎片后加入300 U/mL的膠原酶Ⅱ和透明質(zhì)酸酶，于37℃水浴箱中消化30～60 min，經(jīng)PBS緩沖液沖洗、通過(guò)70 μm濾器獲得單細(xì)胞懸液備流式分析用。小鼠巨噬細(xì)胞的獲得/培養(yǎng)：脫頸處死6～8周齡昆明品系小鼠，經(jīng)75%酒精浸泡后向腹腔注入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液，靜置5～7 min后無(wú)菌條件下切開(kāi)小鼠腹腔，用注射器抽取腹腔液經(jīng)離心洗滌后顯微鏡下計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至5×104個(gè)/mL接種于含完全培養(yǎng)基的24孔板內(nèi)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后備實(shí)驗(yàn)用。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD47的表達(dá) 將上述獲得的卵巢組織單細(xì)胞細(xì)胞懸液經(jīng)PBS-EDTA緩沖液（PBE）清洗去除上清，用100 μL PBE重懸細(xì)胞制成兩份標(biāo)本。一份標(biāo)本（空白管）不加抗體用作空白對(duì)照；另一份標(biāo)本（樣品管）加入鼠抗人CD47-FITC單克隆抗體5 μL，混勻，4℃孵育30 min；PBE清洗1次，重懸于0.5 mL PBE中用于流式分析檢測(cè)（計(jì)數(shù)105個(gè)細(xì)胞用于分析）。

1.2.3 細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn) 制備人卵巢癌細(xì)胞系SKOV-3單細(xì)胞懸液，將顯示綠色熒光的CFSE（1 μm/mL，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)避光操作）標(biāo)記于SKOV-3細(xì)胞上，調(diào)整細(xì)胞密度至2×105個(gè)/mL接種于上述備實(shí)驗(yàn)用的巨噬細(xì)胞中。加入功能實(shí)驗(yàn)用鼠抗人CD47單克隆抗體、鼠抗人HLA單克隆抗體、鼠IgG1同型對(duì)照抗體于孵箱中與小鼠巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)2 h，吸棄上清液，PBS清洗2次，于熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)被吞噬的腫瘤細(xì)胞。結(jié)果判斷：吞噬指數(shù)=被吞噬的CFSE標(biāo)記的卵巢癌細(xì)胞/100個(gè)巨噬細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩樣本均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)采用方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同卵巢組織細(xì)胞中CD47的表達(dá)水平及其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

流式細(xì)胞儀結(jié)果分析顯示，正常人卵巢上皮細(xì)胞中CD47呈低表達(dá)，卵巢癌組織細(xì)胞和SKOV-3中CD47呈高表達(dá)，均高于正常人卵巢上皮細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，表1，圖1）。分析CD47表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系可見(jiàn)其與患者的年齡、病理類型、臨床分期無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與分化程度相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.046，表2）。

表1 不同卵巢細(xì)胞中CD47表達(dá)水平的差異Table 1 Expression of CD47 in different kinds of ovarian cells

圖1 正常卵巢組織與卵巢癌組織細(xì)胞中CD47的表達(dá)水平Figure 1 Expression of CD47 in normal ovarian cells and ovarian cancer cells

表2 卵巢癌組織細(xì)胞CD47表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系Table 2 Relationship of the expression of CD47 in ovarian cancer cells with clinicopathologic features

2.2 抗CD47單克隆抗體對(duì)巨噬細(xì)胞的促進(jìn)吞噬作用

小鼠巨噬細(xì)胞與卵巢癌腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)的體外實(shí)驗(yàn)表明，抗CD47單克隆抗體可明顯促進(jìn)巨噬細(xì)胞對(duì)卵巢癌腫瘤細(xì)胞的吞噬作用，同抗體本身的作用及HLA抗體機(jī)制介導(dǎo)的免疫作用無(wú)關(guān)。隨著所用抗體濃度的改變，其吞噬指數(shù)呈明顯的劑量依賴關(guān)系（圖2）。5 μg/mL抗CD47組巨噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)（0.28±0.02）較對(duì)照組增加，明顯強(qiáng)于 1 μg/mL抗CD47組0.17±0.02，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。同樣，10 μg/mL抗CD47組巨噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)（0.39±0.02）較對(duì)照組增加，明顯強(qiáng)于 5 μg/mL抗CD47組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。20 μg/mL抗CD47組巨噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)（0.40±0.01）較對(duì)照組增加，與10 μg/mL抗CD47組對(duì)巨噬細(xì)胞的促吞噬作用比較無(wú)顯著性差異（P=0.235）。熒光顯微鏡下清晰的看出CFSE標(biāo)記的卵巢癌細(xì)胞系SKOV-3細(xì)胞被小鼠巨噬細(xì)胞吞噬（圖3）。

圖2 不同濃度下抗CD47單克隆抗體對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬作用的影響Figure 2 Relationship between anti-CD47 monoclonal antibody concen?tration and the phagocytosis index

圖3 熒光顯微鏡觀察小鼠巨噬細(xì)胞對(duì)CFSE標(biāo)記的卵巢癌腫瘤細(xì)胞的吞噬作用（×200，紅色箭頭C所示）Figure 3 Phagocytosis of CFSE-labeled ovarian cancer cells by mouse macrophages（×200，as indicated by the red arrowhead）

3 討論

CD47又稱整合素相關(guān)蛋白，廣泛表達(dá)于機(jī)體各類細(xì)胞表面，是抑制性受體人信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α（sig?nal-regulatory protein alpha，SIRPα）的胞外配體，而SIRPα主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞表面，CD47與SIRPα結(jié)合引起SIRPα中酪氨酸磷酸化，傳導(dǎo)抑制性信號(hào)即“別吃我”信號(hào)而降低巨噬細(xì)胞的吞噬活性，從而對(duì)固有免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抑制作用［3-5］。本研究結(jié)果不但證實(shí)CD47在卵巢癌組織細(xì)胞呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，與已研究的結(jié)果相一致［6］，并且進(jìn)一步證實(shí)其與卵巢癌的分化程度相關(guān)。流式細(xì)胞儀結(jié)果分析顯示，CD47在卵巢癌組織細(xì)胞和SKOV-3細(xì)胞中的表達(dá)，均高于正常人卵巢上皮細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），并且同卵巢癌的分化程度相關(guān)（P＜0.05），提示CD47的表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度具有相關(guān)性。然而統(tǒng)計(jì)分析表明CD47的表達(dá)水平同卵巢癌的臨床分期無(wú)顯著關(guān)系（P＞0.05），可能與本實(shí)驗(yàn)樣本量尚不充足有關(guān)，后續(xù)需擴(kuò)大樣本量行進(jìn)一步分析。而進(jìn)一步體外細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，應(yīng)用抗CD47單克隆抗體在熒光顯微鏡下可清晰的看出經(jīng)CFSE標(biāo)記的卵巢癌細(xì)胞系SKOV-3腫瘤細(xì)胞被小鼠巨噬細(xì)胞吞噬。通過(guò)計(jì)算吞噬指數(shù)，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組應(yīng)用抗CD47單克隆抗體后巨噬細(xì)胞的吞噬作用得到顯著增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。并且隨著所用抗體濃度的改變，其吞噬指數(shù)呈明顯的劑量依賴關(guān)系，即抗體濃度越高，吞噬指數(shù)越大，吞噬功能越強(qiáng)，當(dāng)抗體濃度為10μg/mL時(shí)吞噬功能達(dá)到峰值，這可能與抗體濃度達(dá)到飽和的狀態(tài)有關(guān)。

因此，本研究結(jié)果證實(shí)CD47與卵巢癌腫瘤細(xì)胞的抗巨噬細(xì)胞吞噬作用有著顯著的關(guān)系，應(yīng)用抗CD47單克隆抗體能夠顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬作用，同抗體本身的作用及HLA抗體機(jī)制介導(dǎo)的免疫作用無(wú)關(guān)（P＜0.01），由此可見(jiàn)在卵巢癌中腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的殺傷也是通過(guò)CD47-SIRPα這一通路的介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)的。既往在白血?。?］、膀胱癌［8］、乳腺癌［9］、非霍奇金淋巴瘤［10］等惡性腫瘤的研究中表明CD47的高表達(dá)狀態(tài)同疾病的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，而應(yīng)用抗CD47單克隆抗體能夠特異性的作用于腫瘤細(xì)胞促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬作用從而獲得了可喜的成果。應(yīng)用抗CD47單克隆抗體可明顯增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)人白血病干細(xì)胞的吞噬作用［7，11-12］；在膀胱癌的體外實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用CD47單克隆抗體可明顯促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬活性［8］；在移植人非霍奇金淋巴瘤的免疫缺陷小鼠上，應(yīng)用抗CD47單克隆抗體可顯著降低淋巴瘤的負(fù)荷并延長(zhǎng)總的存活期，而聯(lián)合應(yīng)用利妥昔單抗治療時(shí)甚至能夠使淋巴瘤消失而獲得治愈［10，13］。由此可見(jiàn)應(yīng)用CD47單克隆抗體在腫瘤的靶向治療中顯示了強(qiáng)大的治療作用，為腫瘤治療的發(fā)展帶來(lái)了新的曙光［14-15］。

本研究于體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，應(yīng)用抗CD47單克隆抗體可顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)卵巢癌腫瘤細(xì)胞的吞噬作用，而在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用抗CD47單克隆抗體是否能夠同樣取得顯著的效果尚需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。因此本研究結(jié)果為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究提供了的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和基礎(chǔ)。

期待抗CD47單克隆抗體的應(yīng)用給卵巢癌的治療帶來(lái)新的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，為卵巢癌的靶向治療提供新的探索方向。

1 Kobayashi E,Ueda Y,Matsuzaki S,et al.Biomarkers for screening,diagnosis,and monitoring of ovarian cancer[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2012,21(11):1902-1912.

2 Chan A,Gilks B,Kwon J,et al.New insights into the pathogenesis of ovarian carcinoma:time to rethink ovarian cancer screening[J].Obstet Gynecol,2012,120(4):935-940.

3 Matozaki T,Murata Y,Okazawa H,et al.Functions and molecular mechanisms of the CD47-SIRPalpha signalling pathway[J].Trends Cell Biol,2009,19(2):72-80.

4 Zhao XW,van Beek EM,Schornagel K,et al.CD47-signal regula?tory protein-alpha(SIRPalpha)interactions form a barrier for anti?body-mediated tumor cell destruction[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2011,108(45):18342-18347.

5 Olsson M,Nilsson A,Oldenborg PA.Target cell CD47 regulates macrophage activation and erythrophagocytosis[J].Transfus Clin Biol,2006,13(1-2):39-43.

6 Campbell IG,Freemont PS,Foulkes W,et al.An ovarian tumor marker with homology to vaccinia virus contains an IgV-like re?gion and multiple transmembrane domains[J].Cancer Res,1992,52(19):5416-5420.

7 Majeti R,Chao MP,Alizadeh AA,et al.CD47 is an adverse prog?nostic factor and therapeutic antibody target on human acute my?eloid leukemia stem cells[J].Cell,2009,138(2):286-299.

8 Chan KS,Espinosa I,Chao M,et al.Identification,molecular char?acterization,clinical prognosis,and therapeutic targeting of human bladder tumor-initiating cells[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2009,106(33):14016-14021.

9 Nagahara M,Mimori K,Kataoka A,et al.Correlated expression of CD47 and SIRPA in bone marrow and in peripheral blood predicts recurrence in breast cancer patients[J].Clin Cancer Res,2010,16(18):4625-4635.

10 Chao MP,Alizadeh AA,Tang C,et al.Anti-CD47 antibody syner?gizeswith rituximab to promotephagocytosisand eradicate non-Hodgkin lymphoma[J].Cell,2010,142(5):699-713.

11 Chao MP,Alizadeh AA,Tang C,et al.Therapeutic antibody target?ing of CD47 eliminates human acute lymphoblastic leukemia[J].Cancer Res,2011,71(4):1374-1384.

12 Majeti R.Monoclonal antibody therapy directed against human acute myeloid leukemia stem cells[J].Oncogene,2011,30(9):1009-1019.

13 Chao MP,Tang C,Pachynski RK,et al.Extranodal dissemination of non-Hodgkin lymphoma requires CD47 and is inhibited by an?ti-CD47 antibody therapy[J].Blood,2011,118(18):4890-4901.

14 Chao MP,Weissman IL,Majeti R.The CD47-SIRPalpha pathway in cancer immune evasion and potential therapeutic implications[J].Curr Opin Immunol,2012,24(2):225-232.

15 Kim D,Wang J,Willingham SB,et al.Anti-CD47 antibodies pro?mote phagocytosis and inhibit the growth of human myeloma cells[J].Leukemia,2012,26(12):2538-2545.