芹菜素增強(qiáng)阿司匹林對結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖抑制作用及其機(jī)制研究*

劉 斌 劉太香 白 明 王 偉 劉 銳 鄧 婷 周禮鯤巴 一

結(jié)腸癌是常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類的健康［1］。COX-2在結(jié)腸癌發(fā)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其抑制劑阿司匹林已經(jīng)成為結(jié)腸癌防治的重要藥物［2］，臨床試驗證明它在結(jié)腸癌的防治中具有確切作用，但是長期服用引起的胃腸道出血等不良反應(yīng)制約了其臨床應(yīng)用［3-4］。食物黃酮類化合物是廣泛存在于植物中的無毒、具有多種生物活性的天然化合物。芹菜素是一種在蔬菜、水果、茶葉中含量豐富的黃酮類化合物，具有抗腫瘤、抗炎癥等多種生物活性，并且對COX-2有抑制作用［5］。本實驗旨在觀察芹菜素能否增強(qiáng)阿司匹林對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的抑制，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

HT-29、HCA-7、Moser和DLD-1細(xì)胞由南京大學(xué)生命科學(xué)院贈送。COX-2（4842）、IκBα（9242S）抗體購自Cell Signaling公司。GAPDH（MB001）抗體購自Bioworld Technology公司。MTT、阿司匹林（A5376）和芹菜素（10798-25Mg）購自Sigma-Aldrich公司。TNF-α購自北京義翹神州生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HT-29、HCA-7、Moser與DLD-1細(xì)胞分別在含有10%胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酸、非必需氨基酸和丙酮酸鈉的DMEM或1640高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所有細(xì)胞系均在37℃、5%CO2濕化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 MTT實驗 細(xì)胞以5×103個的密度種植在96孔板中。處理細(xì)胞后加入終濃度為0.5 mg/mL的MTT，培養(yǎng)箱中放置4 h后，在酶標(biāo)儀上以570 nm的波長檢測OD值，計算細(xì)胞增殖抑制率=（對照孔OD均值-試驗孔OD均值）/（對照孔OD均值-空白孔OD均值）×100%。

1.2.3 免疫印跡法檢測蛋白表達(dá) 以1×105個的密度將細(xì)胞種植在6孔板中，不同藥物處理細(xì)胞后以裂解液裂解細(xì)胞，離心后用SDS-PAGE分離膠分離上清中的蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移到PDF膜上，用相應(yīng)的一抗和二抗孵育后收集圖像。

1.2.4 RT-PCR檢測mRNA水平 以1×105個的密度將細(xì)胞種植在6孔板中，不同處理方式處理細(xì)胞后用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，之后進(jìn)行RT-PCR，在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳并收集圖像。COX-2的正向引物為5'-GGGAAGCCTTCTCTAACCTC-3'，反向引物為5'-CTGCTTGTCTGGAACAACTG-3'，退火溫度為60℃。GAPDH的正向引物為5'-ACCACAGTCCAT?GCCATCAC-3'，反向引物為 5'-TCCACCACCCTGTT?GCTGTA-3'，退火溫度為60℃。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 芹菜素增強(qiáng)阿司匹林對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的抑制

用MTT法檢測細(xì)胞存活率，結(jié)果顯示，處理細(xì)胞72 h后，對表達(dá)COX-2的HT-29、HCT-7和Moser細(xì)胞，芹菜素對細(xì)胞的增殖抑制率為17%～27%，不同濃度阿司匹林對細(xì)胞增殖的抑制率為3%～41%，聯(lián)合應(yīng)用則對細(xì)胞增殖的抑制率達(dá)30%～73%；對不表達(dá)COX-2的DLD-1細(xì)胞，單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用對增殖抑制率無明顯影響（圖1A）。另外，在24、48、72 h分別檢測不同處理方式對表達(dá)COX-2的HT-29、HCT-7和Moser細(xì)胞的增殖的影響，結(jié)果顯示，處理48、72 h后，芹菜素明顯增強(qiáng)阿司匹林對細(xì)胞增殖的抑制（圖1B）。這提示，芹菜素能增強(qiáng)阿司匹林對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的抑制，并且此作用可能依賴于COX-2。另外，對以上計量資料結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析顯示，芹菜素與阿司匹林對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的抑制存在協(xié)同增強(qiáng)作用。

2.2 不同結(jié)腸癌細(xì)胞系中COX-2表達(dá)水平的檢測

由于COX-2在結(jié)腸癌發(fā)展中有重要作用，用免疫印跡法檢測不同結(jié)腸癌細(xì)胞系中COX-2的表達(dá)水平（圖2）。結(jié)果顯示，COX-2在HCA-7、Moser、HT-29細(xì)胞中表達(dá)，而在DLD-1細(xì)胞中未檢測到。

2.3 芹菜素對結(jié)腸癌細(xì)胞COX-2表達(dá)的抑制

選用表達(dá)COX-2的Moser細(xì)胞系來檢測芹菜素對COX-2表達(dá)的抑制。用不同濃度的芹菜素處理細(xì)胞，48 h后免疫印跡法檢測COX-2的表達(dá)（圖3）。結(jié)果顯示，芹菜素能夠劑量依賴性地抑制Moser細(xì)胞系中COX-2的表達(dá)。

圖2 不同結(jié)腸癌細(xì)胞系中COX-2的表達(dá)Figure 2 Expression of COX-2 in different colorectal cancer cell lines

圖3 芹菜素抑制Moser細(xì)胞中COX-2的表達(dá)Figure 3 Apigenin inhibits the expression of COX-2 in Moser cells

2.4 芹菜素增強(qiáng)阿司匹林對COX-2表達(dá)的抑制

由于COX-2在結(jié)腸癌發(fā)展中有重要作用，而且本研究已經(jīng)證明芹菜素能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞中COX-2的表達(dá)，接下來用免疫印跡法和RT-PCR檢測芹菜素和阿司匹林對COX-2表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，處理細(xì)胞48 h后，在蛋白（圖4A）和mRNA（圖4B）水平上，芹菜素增強(qiáng)阿司匹林對COX-2表達(dá)的抑制。此結(jié)果提示，芹菜素增強(qiáng)阿司匹林抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖是通過抑制COX-2的表達(dá)實現(xiàn)的。

圖4 芹菜素增強(qiáng)阿司匹林對Moser細(xì)胞中COX-2表達(dá)的抑制Figure 4 Apigenin enhances the aspirin-mediated inhibition of COX-2 expression in Moser cells

2.5 芹菜素增強(qiáng)阿司匹林對TNF-α誘導(dǎo)的IκBα降解的抑制

由于NF-κB的入核和轉(zhuǎn)錄活性可以調(diào)節(jié)COX-2的表達(dá)，本研究用芹菜素與阿司匹林處理Moser細(xì)胞2 h后，用3 ng/mL的TNF-α處理30 min，然后用免疫印跡法檢測IκBα的降解情況。結(jié)果顯示，芹菜素增強(qiáng)阿司匹林對由TNF-α誘導(dǎo)的IκBα降解的抑制（圖5）。提示芹菜素增強(qiáng)阿司匹林對結(jié)腸癌細(xì)胞COX-2表達(dá)的抑制可能是通過抑制IκBα的降解，進(jìn)而抑制NF-κB的入核和轉(zhuǎn)錄活性而實現(xiàn)的。

圖5 芹菜素增強(qiáng)阿司匹林對Moser細(xì)胞中IκBα降解的抑制Figure 5 Apigenin enhances the aspirin-mediated inhibition of IκBα degradation in Moser cells

3 討論

COX主要包括COX-1和COX-2，在腫瘤形成過程中COX-2能被誘導(dǎo)性表達(dá)，對結(jié)直腸癌的發(fā)生具有重要作用［2，6］。人們發(fā)現(xiàn)在人結(jié)直腸癌和結(jié)直腸癌動物模型中COX-2的表達(dá)均上調(diào)，而且升高的COX-2與較差的生存率有關(guān)。COX-2促癌機(jī)制包括促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制凋亡，促進(jìn)腫瘤血管生成，增加腫瘤的播散等［7-8］。

NF-κB在結(jié)直腸癌的進(jìn)展中尤為重要，NF-κB的組成性活化明顯增加結(jié)直腸癌的風(fēng)險［3］。大多數(shù)結(jié)直腸癌存在NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子的組成性活化［7-8］。在未受刺激時，NF-κB可被其特異性抑制劑IκB抑制而以非活化狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中。IKKβ被激活后能磷酸化IκB，導(dǎo)致IκB的降解，游離出NF-κB（主要是p50/p65）遷移到細(xì)胞核，調(diào)節(jié)COX-2等基因的轉(zhuǎn)錄而促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)展［7，9］。因此，NF-κB是結(jié)直腸癌的一個重要的治療靶點(diǎn)［9-10］。

阿司匹林是非選擇性COX抑制劑，可以選擇性乙?；疌OX上的絲氨酸位點(diǎn)而不可逆地滅活COX，然而阿司匹林發(fā)揮抗腫瘤作用主要是通過抑制COX-2的活性而實現(xiàn)的。此外，阿司匹林還可以通過抑制COX-1以及非COX依賴性的機(jī)制而發(fā)揮抗腫瘤作用［3-4，11］。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)常使用阿司匹林能夠減少高表達(dá)COX-2的人群的結(jié)直腸癌的風(fēng)險，能降低已確診的結(jié)直腸癌患者（尤其是高表達(dá)COX-2）的疾病特異性死亡率，但是對COX-2弱或無表達(dá)的結(jié)直腸癌的風(fēng)險并無影響［12-13］。阿司匹林還能抑制NF-κB對COX-2的轉(zhuǎn)錄活性。研究顯示，阿司匹林能抑制TNF誘導(dǎo)的NF-κB激活，抑制IKK活性和IκBα的降解，能劑量依賴性地抑制NF-κB調(diào)節(jié)的COX-2等的表達(dá)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖［14］。

流行病學(xué)研究顯示，結(jié)直腸癌的發(fā)生率與攝入黃酮類化合物的量負(fù)相關(guān)［5］。多種食物黃酮類化合物能抑制NF-κB的活化，調(diào)節(jié)COX-2的表達(dá)，從而影響包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的腫瘤細(xì)胞的增殖［6-7，14］。芹菜素是一種黃酮類化合物，單獨(dú)應(yīng)用即對多種腫瘤起到明顯的抑制作用。其中，芹菜素抑制NF-κB活化，調(diào)節(jié)COX-2表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞增殖是它發(fā)揮抗腫瘤作用的重要機(jī)制［5-6］。有研究顯示，芹菜素可通過非p53依賴性凋亡抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖，還能通過誘導(dǎo)乳腺癌T47D細(xì)胞p53依賴性凋亡及G2/M期阻滯而抑制增殖［15-16］。人們每天從飲食中可以攝入大量芹菜素，有報道顯示，斯堪的納維亞人的每日攝入量達(dá)75～81 mg［5］。攝入2 g/kg體重的歐芹（7.2±1.3）h后，芹菜素的血漿濃度可達(dá)（127±81）nmol/L［17-18］。

本研究選擇了HT-29、HCA-7、Moser和DLD-1結(jié)腸癌細(xì)胞系，經(jīng)驗證，HT-29、HCA-7和Moser細(xì)胞中檢測到COX-2的表達(dá)，而DLD-1細(xì)胞中未檢測到。用阿司匹林與芹菜素單獨(dú)或聯(lián)合處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合處理組明顯抑制前三種細(xì)胞增殖，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，芹菜素和阿司匹林對抑制細(xì)胞增殖具有協(xié)同增強(qiáng)作用。本研究發(fā)現(xiàn)芹菜素能劑量依賴性地抑制COX-2的組成性表達(dá)，在蛋白和mRNA水平上，芹菜素能增強(qiáng)阿司匹林對COX-2表達(dá)的抑制。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，芹菜素增強(qiáng)阿司匹林對由TNF-α誘導(dǎo)的IκBα降解的抑制。因此，本研究推論，芹菜素增強(qiáng)阿司匹林抗結(jié)腸癌作用的機(jī)制是：芹菜素增加阿司匹林對IκBα降解的抑制，抑制NF-κB入核和 NF-κB對COX-2表達(dá)的調(diào)控，進(jìn)而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。本實驗中芹菜素的有效濃度是10 μmol/L，高于此前報道的人體攝入芹菜素后的血漿濃度，提示將本研究結(jié)果應(yīng)用于臨床還需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，本文首次發(fā)現(xiàn)芹菜素能增加阿司匹林的抗結(jié)腸癌作用，并探討了其作用機(jī)制。對芹菜素進(jìn)行深入研究和開發(fā)，對于提高阿司匹林的抗腫瘤作用，降低阿司匹林的劑量以及減少阿司匹林引起的不良反應(yīng)具有重要意義。

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