實時熒光定量法檢測晚期NSCLC惡性胸腔積液及血液腫瘤細胞EGFR基因突變的研究

(江西省腫瘤醫(yī)院，南昌330029)

吉非替尼和厄洛替尼是目前已批準(zhǔn)用于一線治療非小細胞肺癌(NSCLC)的酪氨酸激酶抑制劑(TKI)靶向藥物，但這兩種藥物均依賴于患者表皮生長因子受體(EGFR)突變的存在與否，ASCO于2011年4月11日發(fā)布臨時性臨床指導(dǎo)意見，要求患者在使用TKI藥物前需進行EGFR檢測。目前，檢測EGFR突變的金標(biāo)準(zhǔn)為直接測序法，其敏感度較低，為10% ～20%，且僅用于組織標(biāo)本的檢測。本研究旨在探討晚期NSCLC患者在難以取得手術(shù)組織的情況下，應(yīng)用實時熒光定量PCR擴增胸腔積液及血液中腫瘤細胞EGFR基因是否可準(zhǔn)確判斷其突變的存在與否，進而指導(dǎo)患者是否采取TKI治療。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2010年1月～2011年12月江西省腫瘤醫(yī)院內(nèi)二科NSCLC腺癌患者76例，男27例、女49例，年齡52～77歲。均經(jīng)病理確診，根據(jù)2011年NCCN指南肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，均為Ⅳ期患者，均合并惡性胸腔積液，未接受過TKI類藥物治療。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本的收集 同時收集入選患者的3種標(biāo)本，即組織石蠟切片、外周血、胸腔積液。A:收集活檢的腫瘤組織石蠟切片置于4℃冰箱保存待測，組織切片來源包括支氣管鏡下活檢組織及CT引導(dǎo)性經(jīng)皮肺穿刺活檢組織，均經(jīng)我院病理科診斷為肺腺癌。B:組織經(jīng)病理確診后，清晨空腹抽取患者外周靜脈血4 mL，置于潔凈的乙二胺四乙酸抗凝管中，后按照血液RNA抽提標(biāo)準(zhǔn)操作提取RNA。C:組織經(jīng)病理確診后，收集100 mL以上胸腔積液，以8 000 r/min離心5min，取沉淀;按照組織RNA抽提標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程抽提。

1.2.2 基因組 DNA提取 提取組織 DNA采用TakaRa DEXPAT試劑盒。將3～5片10μm厚的石蠟切片放于Eppendorf管中，加入DNA抽提液10滴，充分混勻，100℃加熱10 min，13 000 r/min離心10 min，吸取其上清直接用于實時熒光定量PCR反應(yīng)。胸腔積液樣本離心后收集細胞團，經(jīng)研磨，Trizol-氯仿分層，取上清，異丙醇沉淀，以75%乙醇洗滌，再次離心，干燥，DEPC水溶解沉淀后獲取組織RNA，RNA經(jīng)紫外分光光度計質(zhì)控后方可使用。采用ABI9700 PCR儀逆轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA，用于實時熒光定量PCR反應(yīng)。外周血樣本加入3倍體積紅細胞裂解液后離心，Trizol-氯仿分層后處理同胸腔積液，提取RNA用于后續(xù)實驗。

1.2.3 熒光定量PCR法分析NSCLC患者組織中EGFR 19～21突變情況 反應(yīng)體系包括:模板50 ng、正反向引物各 25 pmol、Master Mix及 Taqman標(biāo)記探針。每次試驗均設(shè)定各突變的陰、陽性對照孔及空白對照孔。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為:50℃ 2 min，95℃10 min;95℃ 15 s，62℃ 34 s，循環(huán)40次。引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成純化。引物序列:18外顯子:上游:5'-GGCGTGGAAACAGACATAGAA-3';下游:5'-TGGAGTTCCCAAACACTCAG-3'。19外顯子:上游:5'-ATTCGTAGGAGCCCAACAG-3';下游:5'-GCCAGTAATTGCCTGTTTCC-3'。20外顯子:上游:5'-CTCTCCCACTGCATCTGTCA-3';下游:5'-GATGGGACAGGCACTGATT-3'。21 外顯子:上游:5'-GTCAGCAGCGGGTTACATCT-3';下游:5'-AAGCAGCTCTGGCTCACACT-3'。

1.2.4 結(jié)果判定 以無模板對照擴增曲線的最高點為準(zhǔn)設(shè)定閾值。沒有出現(xiàn)擴增曲線或Ct=0的樣本為陰性樣本;出現(xiàn)擴增曲線且Ct≤34.0的樣本為陽性樣本;34.0≤Ct≤38.0的樣本為可疑陽性，需重復(fù);Ct＞38.0為陽性。另外，每次PCR結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，排除假陰性。18號外顯子:2155堿基G→A;19號外顯子:2235-2249堿基，堿基缺失;20號外顯子:2369堿基C→T;21號外顯子:2573堿基T→G。標(biāo)本出現(xiàn)任一突變陽性均記為該標(biāo)本陽性。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS13.0統(tǒng)計軟件，采用χ2檢驗進行組間的兩兩比較，小樣本量采用Fisher確切概率法進行統(tǒng)計學(xué)分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 熒光定量PCR結(jié)果 76例NSCLC的EGFR外顯子18～21中，共檢測出27例有反應(yīng)峰，其中外顯子19缺失突變陽性的樣本17例，外顯子21為7例，突變率分別為22.3%和9.21%(圖1)，而外顯子20突變未檢測到。

圖1 陽性組織的擴增曲線

2.2 3種組織EGFR突變檢測結(jié)果 見表1。外周血、胸腔積液與腫瘤組織的符合率達到80%(24/27、25/27)以上，檢驗結(jié)果表明這3種標(biāo)本來源對EGFR檢測的突變差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均＞0.05)，其中有2例呈現(xiàn)穿刺組織檢測陽性而胸腔積液未檢出，3例穿刺組織陽性而外周血陰性，1例呈現(xiàn)胸腔積液檢測陽性而穿刺組織及外周血未檢出，2例標(biāo)本在穿刺組織中同時存在外顯子19、21突變。

表1 3種不同標(biāo)本EGFR突變檢測結(jié)果(例)

3 討論

目前，EGFR-TKI藥物已廣泛應(yīng)用于肺癌的治療，但其靶點突變檢測卻仍處于較低水平。IPASS研究表明，吉非替尼一線治療EGFR突變陽性患者的有效率明顯高于無突變的患者［1］，但是如不先進行EGFR檢測而直接使用TKI藥物，則死亡風(fēng)險提高約185%［2］。因此，使用TKI藥物前快速準(zhǔn)確進行EGFR檢測至關(guān)重要。

EGFR是erbB酪氨酸激酶受體家族的成員之一，作用機制為通過與配體如EGF、TGF-α結(jié)合，形成同源或異源二聚體，隨后發(fā)生自身磷酸化，激活其下游的信號通路。EGFR基因位于人類7號染色體短臂7p12-14，由28個外顯子組成，其酪氨酸激酶功能區(qū)由外顯子18～24編碼［3］;我國 NSCLC患者EGFR基因突變率約為34%，主要發(fā)生在外顯子19～21，占所有突變的 90%以上［4］。因此，準(zhǔn)確檢測這4個突變基因即可基本了解是否存在EGFR基因突變。

70%～80%的NSCLC患者在確診時即已處于ⅢB～Ⅳ期，喪失手術(shù)機會，無法獲得手術(shù)標(biāo)本，限制了TKI藥物在臨床的使用。本研究結(jié)果顯示，3種來源的標(biāo)本進行EGFR突變檢測均可有效反映患者機體狀態(tài);提示在難以獲取患者病理切片時，可采用外周血及胸腔積液進行EGFR基因突變檢測以協(xié)助診斷;但需要指出的是，本研究在樣本量不大的情況下，仍出現(xiàn)2例胸腔積液標(biāo)本出現(xiàn)假陰性。因此，我們認為在能取得病理組織的情況下，組織切片標(biāo)本仍為評估原發(fā)腫瘤突變性的最佳方案，以排除假陰性的可能。

本研究發(fā)現(xiàn)，EGFR基因存在19/21外顯子雙突變的可能，雙突變的存在必然引起整個基因空間結(jié)構(gòu)的變化，使得下游信號通路激活變化，這一類患者在應(yīng)用TKI藥物時療效如何，對總生存期及無進展生存期影響如何，尚需進一步研究。

本研究中，1例患者胸腔積液存在21號外顯子突變，但外周血及穿刺組織未見突變，提示腫瘤突變存在部位異質(zhì)性。國內(nèi)外資料證實，EGFR基因突變存在異質(zhì)性主要表現(xiàn)為兩種，一是轉(zhuǎn)移部位與原發(fā)部位的不一致，二是治療(主要指化療)干預(yù)后腫瘤病灶EGFR檢測的變換。突變異質(zhì)性的發(fā)現(xiàn)解釋了某些多處轉(zhuǎn)移患者在接受TKI治療后原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶對藥物應(yīng)答的不一致性，也解釋了某些化療前檢測EGFR基因突變陰性的患者在接受規(guī)范化化療后突變檢測陽性的現(xiàn)象，為臨床用藥提供了有益的指導(dǎo)。

綜上所述，應(yīng)用實時熒光定量PCR方法檢測胸腔積液及外周血中腫瘤細胞的EGFR基因突變，可以較準(zhǔn)確地反映NSCLC患者的EGFR突變情況，耗時短，損傷小，標(biāo)本易得且經(jīng)濟實惠，值得臨床推廣。但是由于存在假陰性的可能以及腫瘤異質(zhì)性的存在，仍建議在送檢時多種標(biāo)本兼顧。

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