漆酶的逆膠束萃取條件優(yōu)化的研究

彭 馨,袁興中*,黃華軍,崔凱龍,方振敏,曾光明 (1.湖南大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙410082；2.湖南大學(xué)環(huán)境生物與控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 長(zhǎng)沙 410082)

漆酶的逆膠束萃取條件優(yōu)化的研究

彭 馨1,2,袁興中1,2*,黃華軍1,2,崔凱龍1,2,方振敏1,2,曾光明1,2(1.湖南大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙410082；2.湖南大學(xué)環(huán)境生物與控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 長(zhǎng)沙 410082)

研究了生物表面活性劑逆膠束體系萃取純化漆酶的后萃的過(guò)程.在此逆膠束體系中,表面活性劑采用一種陰離子生物表面活性劑鼠李糖脂(rhamnolipid, RL),溶劑采用異辛烷.分別考察了4種不同離子種類(lèi)(NaCl, NaBr, KCl和KBr)與不同濃度、4種不同助溶劑種類(lèi)(正丁醇,正己醇,正庚醇及正辛醇)與不同比例、乙醇的含量以及溫度對(duì)漆酶的后萃過(guò)程的影響.結(jié)果表明,0.25mol/L KCl或0.20mol/L KBr能夠得到較好的萃取效果;在四種助溶劑中,正己醇(比例為0.5)和正庚醇(比例為0.5)效果比較好;乙醇加入量為 9%效果最優(yōu);最適宜溫度為 35℃.在上述條件下,漆酶的酶活回收率和純化倍數(shù)分別高達(dá) 90%,4.7倍.電泳分析結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了漆酶的純化效果較好.研究證明鼠李糖脂逆膠束萃取酶類(lèi)具有廣闊的應(yīng)用前景.

鼠李糖脂；逆膠束；后萃；漆酶

木質(zhì)素的分解是細(xì)胞內(nèi)酶和細(xì)胞外酶共同作用下的氧化過(guò)程,其在自然界中的降解進(jìn)行困難且緩慢,對(duì)環(huán)境造成了嚴(yán)重的負(fù)擔(dān).漆酶(Laccase)在木質(zhì)素降解的應(yīng)用中起著重要的作用.因此,研究漆酶的純化技術(shù)已成為熱點(diǎn)[1].在目前已經(jīng)有的漆酶純化技術(shù)中,一般仍采用等電點(diǎn)沉淀、鹽析、有機(jī)溶劑分級(jí)分離等方法對(duì)粗酶液進(jìn)行處理,再用凝膠過(guò)濾、離子交換層析、吸附層析、親和層析等方法進(jìn)一步分離提純,操作步驟較為繁雜,酶的活性回收率較低,而且不易規(guī)?；a(chǎn)[2-4].因此,開(kāi)創(chuàng)具有較高活性回收率,并能獲得高純度漆酶的純化方法,將推動(dòng)我國(guó)木質(zhì)纖維素降解酶獲得實(shí)際應(yīng)用.

逆膠束分離純化是針對(duì)生物活性蛋白質(zhì)提出的一種液液萃取技術(shù).逆膠束是表面活性劑在非極性有機(jī)溶劑中超過(guò)臨界膠團(tuán)濃度(CMC)時(shí)自組裝形成的納米尺寸的聚集體,具有良好的熱力學(xué)穩(wěn)定性[5].與傳統(tǒng)的技術(shù)相比,逆膠束萃取具有分離步驟少、操作簡(jiǎn)易、成本較低、選擇性高和不易引起酶蛋白失活變性等諸多優(yōu)勢(shì),在蛋白質(zhì)及酶純化方面體現(xiàn)出更大的潛力,在酶等蛋白質(zhì)的純化應(yīng)用領(lǐng)域突顯著重要意義和良好的應(yīng)用前景[6].采用生物表面活性劑(鼠李糖脂)制備的逆膠束體系可有效避免環(huán)境中化學(xué)試劑大量使用所造成的污染累積,使得工藝流程更具安全性和環(huán)境可持續(xù)性[7].

逆膠束萃取分為前萃和后萃兩個(gè)階段.目前,已經(jīng)有大量文獻(xiàn)報(bào)道了關(guān)于前萃的研究[8-9],而關(guān)于逆膠束萃取的后萃研究較少,特別是漆酶的后萃研究還鮮有報(bào)道.基于此,本研究擬采用鼠李糖脂構(gòu)建逆膠束體系對(duì)漆酶進(jìn)行萃取純化(包括前萃和后萃),并考察離子種類(lèi)和濃度,助溶劑種類(lèi)和濃度以及乙醇的加入量對(duì)漆酶萃取純化后萃過(guò)程的影響,從而為漆酶的萃取純化工業(yè)推廣提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù),對(duì)酶純化的工業(yè)生產(chǎn)具有重要的意義.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 ABTS(Sigam 公司);鼠李糖脂 RL(實(shí)驗(yàn)室自己制備[10]);異辛烷、正丁醇、正己醇、正庚醇、正辛醇、無(wú)水乙醇和KCl、KBr等試劑均為市售分析純.

1.1.2 儀器 紫外分光光度計(jì)(Shimadzu UV-2552,Japan);水浴恒溫振蕩器(WHY-2);超聲波清洗儀; pH計(jì)(PHS-2F,上海雷磁儀恒溫干燥箱.

1.2 方法

1.2.1 漆酶粗酶液的制備 雜色云芝C.Versicolor(ACCC 51171)購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院保藏中心.

云芝發(fā)酵培養(yǎng)基(L-1):2g/L葡萄糖,1.28g/L酒 石酸 銨 ,2g/L KH2PO4, 0.5g/L MgSO4·7H2O,0.076g/L CaCl2·7H2O, 0.001g/L 維生素 B1,1g/L Tween80, 7mL/L微量元素液,10mmol/L 醋酸緩沖溶液(pH4.5).

微量元素混合液:氨基乙酸 0.585g/L,MgSO4·7H2O 2.952g/L,MnSO4·H2O 0.5g/L,NaCI 1g/L,FeSO4·7H2O 0.1g/L,CoCI20.1g/L, CaCI20.1g/L,ZnSO4·7H2O 0.1g/L, CuSO4·5H2O 0.01g/L,KAI(SO4)2·12H2O 0.01g/L,HBO30.01g/L, NaMnO40.006g/L.

制備方法:500mL錐形瓶中裝液體發(fā)酵培養(yǎng)基100mL,高壓滅菌后接種,28℃,180r/min搖床培養(yǎng)6d.8000r/min離心10min得到粗酶液.

1.2.2 萃取 將一定量的鼠李糖脂經(jīng)超聲振蕩溶于以不同比例混合的正X醇/異辛烷的溶液中,形成逆膠束溶液.前萃是將漆酶粗酶液與逆膠束溶液等體積混合,振蕩一定的時(shí)間后以8000r/min離心10min,靜置分相,留取上層有機(jī)相.后萃是將前萃后所得的有機(jī)相和等體積的含一定離子濃度的 0.1mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液混合,振蕩40min,8000r/min離心10min,靜置分相,留取下層水相.采用紫外分光光度法分別測(cè)定所得水相中的蛋白質(zhì)含量和 Lac酶活.實(shí)驗(yàn)條件與本課題組前期研究一致[11].

蛋白質(zhì)后萃率(BEE)定義:后萃水相的蛋白質(zhì)含量與前萃油相中蛋白質(zhì)含量的百分比.漆酶酶活回收率(AR)定義為:后萃水相中酶含量與初始酶液中酶含量的百分比.純化倍數(shù)(PF)為后萃水相中的比酶活與初始酶液的比酶活之比.

1.2.3 漆酶酶活測(cè)定 取 1mL待測(cè)酶液,加入2mL 0.05mmol/L的 ABTS溶液,pH=4.5,反應(yīng)3min,在 420nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度的變化.同反應(yīng)體系做空白樣啟動(dòng)反應(yīng).一個(gè)酶活力單位(U)定義為每分鐘氧化ABTS所需的酶量.

1.2.4 蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定 水相中蛋白質(zhì)濃度采用 Folin-酚法.取 1mL樣品溶液,加入 5mL試劑甲混勻,放置10min后加入0.5mL試劑已,立即搖勻,保存 30min,然后于 500nm 處比色,以 1mL代替樣品作空白對(duì)照.測(cè)定后,可從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中查出未知樣品濃度.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同離子對(duì)后萃的影響

離子種類(lèi)和濃度在逆膠束萃取技術(shù)中是一個(gè)很重要的影響因素.在酶純化中,普遍采用Na+,K+和 Ca2+探究陽(yáng)離子對(duì)萃取的影響[12-14].由于Na/Ca-Cl作用和影響十分相似[6],因此本實(shí)驗(yàn)采用 NaCl,NaBr,KCl和 KBr探究 Na+與 K+影響大小程度.不同離子種類(lèi)和濃度對(duì)漆酶后萃的影響如圖 1所示.陽(yáng)離子的種類(lèi)和濃度對(duì)鼠李糖脂形成逆膠束溶液的萃取有明顯的影響.由圖 1(a)可知,當(dāng)NaCl濃度為0.15mol/L時(shí),酶活回收率和純化因子均達(dá)到最大值.雖然此時(shí)蛋白質(zhì)后萃率未達(dá)到最優(yōu)值,但綜合考慮各個(gè)參數(shù),本文采用最佳PF時(shí)的各參數(shù)為最優(yōu)條件.NaCl濃度為0.15mol/L是最優(yōu)濃度.從圖 1(b)可以看出,NaBr最優(yōu)值應(yīng)為0.25mol/L.同理由圖1(c)和圖1(d)得知,KCl和 KBr的最優(yōu)濃度為 0.25mol/L和0.20mol/L.

圖1 不同離子種類(lèi)與濃度對(duì)后萃的影響Fig.1 Effect of ionic strength on backward extraction

由圖1可見(jiàn),隨著4種離子濃度的增加,酶活回收率,后萃率和純化因子大致上都是呈先增加然后降低的趨勢(shì).這一現(xiàn)象可以用雙電層理論進(jìn)行解釋.當(dāng)離子濃度增大時(shí),蛋白質(zhì)與逆膠束表面之間的靜電引力減小,從而降低了酶蛋白在逆膠束中的溶解度,使之由有機(jī)相反萃取回水相[15].雙電層與離子強(qiáng)度之間的關(guān)系為[16]

式中:k為雙電層厚度,cm;I為離子強(qiáng)度, mol/L.

從式(1)可以看出隨著I的增大,逆膠束內(nèi)表面的雙電層變薄,即靜電引力隨著I的增大而減弱:另一方面,逆膠束內(nèi)表面雙電層變薄之后,減小了逆膠束內(nèi)表面極性頭之間的相互斥力,使逆膠束變小.這兩方面會(huì)使漆酶更容易從逆膠束中萃取出來(lái)[17-18].但過(guò)高的離子濃度影響蛋白質(zhì)的溶解,甚至使得蛋白質(zhì)變質(zhì)[18].

在4種離子最優(yōu)值的條件下(NaCl: 0.15mol/L,NaBr:0.25mol/L, KCl:0.25mol/L和KBr:0.2mol/L),純化倍數(shù)對(duì)比發(fā)現(xiàn),K+對(duì)后萃的影響優(yōu)于 Na+的影響.類(lèi)似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果在文獻(xiàn)[19]中也曾出現(xiàn).

2.2 不同助溶劑對(duì)后萃的影響

采用正丁醇、正己醇、正庚醇及正辛醇等4種正構(gòu)醇作為助溶劑,分別以不同的比例加入有機(jī)相異辛烷中,探究助溶劑種類(lèi)和比例對(duì)漆酶后萃過(guò)程的影響,如圖2所示.由圖2(a)可知,當(dāng)正丁醇的比例為0.35時(shí),酶活回收率達(dá)到最大值.而當(dāng)其比例為 0.5時(shí),后萃率和純化倍數(shù)均達(dá)到最大值.從圖 2(b)和圖 2(c)可以看出,正己醇和正庚醇最優(yōu)比例應(yīng)為 0.5,在此條件下,酶活回收率,后萃率和純化倍數(shù)均達(dá)到最大值.由圖 2(d)可知,正辛醇對(duì)后萃的影響不穩(wěn)定,有兩個(gè)峰值,并且酶活回收率在80%以下,后萃率不到30%,純化倍數(shù)與其他助溶劑相比也較低.正己醇體系酶活回收率達(dá)90%,純化倍數(shù)達(dá) 4.7;正庚醇體系酶活回收率達(dá)81%,純化倍數(shù)達(dá) 4.3.因此可以看出,正己醇和正庚醇比較適合作為助溶劑.

圖2 不同助溶劑種類(lèi)與比例對(duì)后萃的影響Fig.2 Effect of co-solvent on backward extraction

在逆膠束體系中,助溶劑分子會(huì)插入到鼠李糖脂的分子之間,因此產(chǎn)生兩方面的影響:一是改變了鼠李糖脂的親水基之間的作用;二是使鼠李糖脂的排列變得松散.這兩方面的影響可以導(dǎo)致鼠李糖脂黏合性降低,從而增加了鼠李糖脂在有機(jī)溶劑中的溶解性[20].加入助溶劑之后,有機(jī)相能夠增溶更多的鼠李糖脂,有利于逆膠束萃取.Jolivalt等[20]研究表明,增加助溶劑的碳鏈長(zhǎng)度會(huì)導(dǎo)致表面活性劑分子頭部集團(tuán)之間的屏蔽作用降低,使得逆膠束體積變大.這一點(diǎn)可以從正己醇、正庚醇和正辛醇均比正丁醇更有利于逆膠束的萃取中得到證實(shí).但同時(shí)實(shí)驗(yàn)表明,正辛醇相對(duì)于正己醇和正庚醇并沒(méi)有體現(xiàn)出明顯的優(yōu)越性,這可能是因?yàn)樘兼滈L(zhǎng)度超過(guò)了合適的范圍,導(dǎo)致萃取不穩(wěn)定.

2.3 不同乙醇加入量對(duì)后萃的影響

在后萃過(guò)程中加入乙醇,會(huì)使得萃取后的分相變得相對(duì)容易,界面非常清晰[18].乙醇能夠降低界面剛性,使得蛋白質(zhì)和逆膠束內(nèi)表面之間的作用減弱,從而使得蛋白質(zhì)更容易從逆膠束中遷移出來(lái),增加界面流動(dòng)性,促進(jìn)逆膠束在界面上的自由活動(dòng).同時(shí)還能減弱酶和表面活性劑極性頭基之間的靜電作用,防止蛋白質(zhì)變性.根據(jù)Mathew 等[21]提出的理論,溶劑參與構(gòu)建逆膠束的外殼,而乙醇則是進(jìn)入逆膠束的水核中,從而使后萃過(guò)程變得容易.

如圖3所示,乙醇加入量(0～24%,V/V)對(duì)后萃的影響呈鐘罩型.當(dāng)乙醇加入量小于 9%時(shí),隨著乙醇的增加,酶活回收率和純化倍數(shù)都有明顯的提高,后萃率也有所增加.當(dāng)乙醇加入量超過(guò) 9%時(shí),隨著乙醇的增加,酶活回收率和純化倍數(shù)均呈下降趨勢(shì).后萃率變化較為平緩,但當(dāng)乙醇加入量超過(guò)12%時(shí),后萃率也開(kāi)始有所降低.本次實(shí)驗(yàn)最佳乙醇加入量為9%.

圖3 不同乙醇加入量對(duì)后萃的影響Fig.3 Effect of ethanol on backward extraction

2.4 溫度對(duì)后萃的影響

漆酶萃取酶活回收率,后萃率和純化倍數(shù)隨溫度的變化(15～50℃)如圖4所示.從圖4可以看出,溫度對(duì)酶活回收率的影響較大,當(dāng)溫度低于35℃時(shí),酶活回收率隨著溫度的升高而增加;當(dāng)溫度為 35℃時(shí),酶活回收率達(dá)到最高值;當(dāng)溫度高于 35℃時(shí),酶活回收率隨著溫度的升高而降低.而溫度對(duì)后萃率的影響并不大,后萃率比較穩(wěn)定,在溫度為30℃時(shí)達(dá)到相對(duì)較大值.純化倍數(shù)隨溫度的變化與酶活回收率的變化比較一致,在35℃時(shí)達(dá)到最大值.綜合考慮,35℃為最佳溫度.

較低的溫度不利于逆膠束萃取,而過(guò)高的溫度會(huì)使酶活性和萃取效率降低.這一點(diǎn)與前人的研究結(jié)果較為一致,如Yu等[22]采用AOT逆膠束體系萃取純化酵母酶的研究、Liu等[23]采用AOT逆膠束體系純化納豆激酶的研究和Dekker等[24]采用頓巴黃銅逆膠束體系研究溫度對(duì)α-淀粉酶增溶性的研究.

圖4 溫度對(duì)后萃的影響Fig.4 Effect of temperature on backward extraction

3 結(jié)論

3.1 采用陰離子生物表面活性劑鼠李糖脂構(gòu)建逆膠束體系萃取漆酶,在后萃過(guò)程中加入不同種類(lèi)與濃度的離子,最佳離子為KCl或KBr,其最佳濃度值分別為0.25mol/L和0.20mol/L.

3.2 考察了加入不同種類(lèi)與比例的助溶劑對(duì)后萃的影響,確定最佳助溶劑為正己醇或正庚醇(體積均比例為0.5).

3.3 考察了不同乙醇含量對(duì)后萃的影響,結(jié)果表明,乙醇加入量 9%為最優(yōu).在最優(yōu)的條件下,酶活回收率為90%,純化倍數(shù)為4.7.

3.4 考察了不同溫對(duì)后萃的影響,結(jié)果表明35℃時(shí)酶活回收率及純化倍數(shù)均達(dá)到最大值,為最佳溫度.

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Purification progress of laccase by reversed micelle system.

PENG Xin1,2, YUAN Xing-zhong1,2*, HUANG Hua-jun1,2,CUI Kai-long1,2, FANG Zhen-min1,2ZENG Guang-ming1,2(1.College of Environmental Science and Engineering, Hunan University, Changsha 410082, China；2.Key Laboratory of Environmental Biology and Pollution Control, Hunan University, Ministry of Education, Changsha 410082, China).China Environmental Science, 2013,33(5)：904～909

Backward extraction of laccase by an innovative method, biosurfactant-based reversed micellar extraction(RME) was studied. In this reversed micelle system, rhamnolipid (RL), a kind of anionic biosurfactant, was employed and isooctane was used as solvent. Four different salts type (NaCl, NaBr, KCl and KBr) with different concentration and four different co-solvent type(n-butanol, n-hexanol, n-heptanol and n-octanol) with different ratio were added respectively in the RME. The effects of ethanol and temperature on backward extraction were studied. The experimental results showed that the impact of KCl (0.25mol/L) on backward extraction approximately equal to KBr (0.20mol/L). Optimum co-solvent was n-hexanol or n-heptanol both with the ratio of 50%. Ethanol was added in backward extraction process and the appropriate volume was 9%. The optimum temperature during backward was 35℃. The best activity recovery and purification fold were 90% and 4.7. The analysis results of SDS-PAGE further proved that laccase was successfully purified. The research indicated RL-RME has huge potential in extraction industry.

rhamnolipid；reversed micellar extraction；backward extraction；laccase

X17

A

1000-6923(2013)05-0904-06

2012-08-30

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(50978087/21276069)

* 責(zé)任作者, 教授, yxz@hnu.edu.cn

彭 馨(1987-),女,內(nèi)蒙古烏海人,湖南大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院碩士研究生,研究方向?yàn)閺U物資源化.