人SCARB2蛋白提高人腸道病毒71型對轉(zhuǎn)基因小鼠的感染力

修晶輝，劉江寧，楊亞軍，夏咸柱 ，張連峰*

(1.醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實(shí)驗(yàn)室，北京 100021;2軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)學(xué)院，軍事獸醫(yī)研究所，吉林省人畜共患病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林省長春市 130122)

人腸道病毒71型(EV71)是微核糖核酸病毒科腸病毒屬腸病毒種A型RNA病毒［1］，1969年首次在加利福尼亞神經(jīng)異常的病人體內(nèi)分離并鑒定［2］。EV71被認(rèn)為是嬰幼兒手足口病(HFMD)的主要病原體之一［3，4］。該病毒感染偶爾伴隨嚴(yán)重的并發(fā)癥，包括腦干腦炎、無菌性腦膜炎、肺水腫或肺出血、急性弛緩性麻痹和心力衰竭［5］。最近幾十年，EV71感染引起的手足口病疫情在世界范圍內(nèi)大爆發(fā)，目前主要集中于亞太地區(qū)［5－10］。中國大陸的EV71病毒感染始見于1987年冬季湖北省HFMD的流行，自1999年以來，我國廣東、福建、上海、重慶等地區(qū)也報(bào)告了局部流行的EV71感染，與1998年臺灣地區(qū)報(bào)道120，000例爆發(fā)手足口病，其中有78例死亡［5］不同，大陸EV71引起的HFMD和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀較輕。以往研究認(rèn)為人脊髓和腦干是 EV71感染的靶標(biāo)［8，11］，但其感染機(jī)制和致病機(jī)制尚不明確。

2009年日本學(xué)者首次利用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)鑒定了EV71的兩種人受體蛋白［12，13］，分別為 P 選擇素糖蛋白配體 1(P-selectin glycoprotein ligand-1，PSGL-1)［13］和人清道夫受體 B2(SCARB2)。通過建立表達(dá)PSGl-1的轉(zhuǎn)基因小鼠，我們證實(shí)人PSGL-1有一定的促進(jìn)EV71感染轉(zhuǎn)基因小鼠的功能。為進(jìn)一步在體內(nèi)證實(shí)人SCARB2的受體功能，以期改良現(xiàn)有的EV71感染小鼠模型，我們通過建立表達(dá)人SCARB2基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，在體內(nèi)驗(yàn)證了該蛋白的受體功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器

硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter membrane，簡稱NC膜)(Millipore，美國)，小鼠抗 SCARB2多克隆抗體(Abnova，德國)，HRP-偶聯(lián)的羊抗小鼠二抗(Santa Cruz，美國)，HRP-偶聯(lián)的 GAPDH 單克隆抗體(康成生物，中國)，倒置顯微鏡(Nikon TS100，日本)，分子克隆用限制性內(nèi)切酶、連接酶、聚合酶均購自日本 Takara公司，熒光定量 PCR儀(Life Technologies，美國)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物

無特定病原體(specific-pathogen free，SPF)ICR小鼠，6周齡，雌性，體重18～20g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2007-0001】，在本實(shí)驗(yàn)室 SPF動物房【SYXK(京)2009-0003】飼養(yǎng)。病毒感染實(shí)驗(yàn)在動物生物安全二級實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。所有實(shí)驗(yàn)操作程序均經(jīng)過醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所實(shí)驗(yàn)動物使用管理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號為GC-09-2001)。

1.2 方法

1.2.1 SCARB2表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因

pCMV6-XL5-h-SCARB2質(zhì)粒購自美國Origene公司(Clone ID NM_002257)。EcoR I和Xho I酶切回收h-SCARB2片段，并克隆入pCDNA3.1(+)質(zhì)粒中巨細(xì)胞瘤病毒(CMV)啟動子下游，構(gòu)建全身表達(dá)人SCARB2的載體。轉(zhuǎn)基因載體經(jīng)測序驗(yàn)證后，用Pvu I將載體線性化，Sephedex G50柱純化。將DNA濃度調(diào)整至5ng/uL，用顯微注射法將DNA注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，用ICR小鼠作假孕受體，制備轉(zhuǎn)基因小鼠(TE2000U顯微注射儀)。

1.2.2 轉(zhuǎn)基因小鼠鑒定

用堿裂解法提取轉(zhuǎn)基因小鼠鼠尾基因組DNA，用PCR法對轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行基因型檢測。所用引物為，h-SCARB2F:5’TCAGCGACAATTACCAGC TC，h-SCARB2R:5’GGAGCACACCATCACACATC(Invitrogen)。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3min;94℃，30s，50℃，30s，72℃，30s，30 個(gè)循環(huán)。PCR 目的片段長度為474bp。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse-transcriptase PCR)

將30mg的轉(zhuǎn)基因小鼠肌肉或腦組織加入1mL TRIzol(Invitrogen)中，勻漿破碎，提取總 RNA，經(jīng)DNase處理后，使用Fermentas逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過PCR擴(kuò)增人SCARB2的cDNA，引物為h-SCARB2F和h-SCARB2R。PCR產(chǎn)物分別用電泳和測序驗(yàn)證。

1.2.4 感染實(shí)驗(yàn)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR，qRT-PCR)

21日齡的轉(zhuǎn)基因小鼠(TG)(n=6)和同窩陰性小鼠(NTG)(n=6)分別腹腔注射2×106TCID50的EV71MP10型病毒體積為200μL。所用毒株為中國大陸地區(qū)流行的C4亞型EV71毒株的小鼠適應(yīng)株［14］，毒株序列號為:HQ712020。

根據(jù)1.2.3所述提取組織總RNA并制備cDNA后，用文獻(xiàn)所述引物和方法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR［14］，GAPDH 作為內(nèi)參。

1.2.5 Western Blot鑒定人SCARB2蛋白表達(dá)

Western blot用于分析轉(zhuǎn)基因小鼠組織內(nèi)人SCARB2蛋白的表達(dá)情況。分別提取轉(zhuǎn)基因小鼠F1代肌肉和腦組織的總蛋白，以同窩陰性小鼠作對照，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉后，用小鼠抗人SCARB2抗體(1∶10000)和HRP-偶聯(lián)的羊抗小鼠二抗(1∶10000)處理后顯色，以 HRP-偶聯(lián)的 GAPDH單克隆抗體作為內(nèi)參。

注:M:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1-4:首建鼠;NTG:同窩陰性小鼠;TG:轉(zhuǎn)基因小鼠;A:PCR鑒定陽性首建鼠;B:逆轉(zhuǎn)錄PCR分析轉(zhuǎn)基因小鼠組織內(nèi)人SCARB2基因表達(dá);C:Western Blot分析人SCARB2蛋白在轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中的表達(dá)，GAPDH為內(nèi)參;D:Western Blot分析人SCARB2蛋白在轉(zhuǎn)基因小鼠骨骼肌組織中的表達(dá)，GAPDH為內(nèi)參。圖1 人SCARB2轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建及鑒定Note:M:DNA molecular weight standard;Lane1-4:Transgenic mouse line;NTG:Negative littermates;TG:Transgenic mice;A:Transgenic mice lines identification by PCR using the tail genomic DNA as template;B:Reverse-transcriptase PCR analysis the human SCARB2 gene expression in tissues of Tg mice;C:Western blot detected the expression of human SCARB2 protein synthesis in brain of Tg mice;D:Western blot detected the expression of human SCARB2 protein synthesis in muscle of Tg mice.The data were normalized to GAPDH expression.Fig.1 Establishment and identification of the transgenic mice expressing human SCARB2

1.2.6 免疫組化

將轉(zhuǎn)基因小鼠和同窩陰性小鼠的肌肉和腦組織用4%福爾馬林固定后，脫水、石蠟包埋及切片，使用小鼠抗人SCARB2的抗體或小鼠抗EV71 VP1蛋白的單抗作為一抗(1∶10000)4°C孵育過夜，HRP標(biāo)記的羊抗小鼠抗體作為二抗 (1∶5000稀釋，sigma)37℃孵 育1 h，用3-3'二 氨 基 聯(lián) 苯 胺 (3-3'diaminobenzidine，DAB)顯色［18］后，光學(xué)顯微鏡觀察。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以 Mean ± S.E.M.表示，用Student’s t-tests或one-way ANOVA分析處理數(shù)據(jù)，P＜0.05為有顯著性差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 表達(dá)人SCARB2蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠建立

經(jīng)鼠尾DNA PCR對首建鼠的基因型進(jìn)行鑒定，得到陽性首建鼠3只(圖1A)。隨后，用逆轉(zhuǎn)錄PCR分析了首建鼠F1代組織中目的基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)人SCARB2主要在轉(zhuǎn)基因小鼠的骨骼肌和腦組織中表達(dá)(圖1B)。隨后，分別用Western Blot和免疫組化分析了人SCARB2蛋白在腦和骨骼肌組織中的表達(dá)情況。由于人SCARB2與小鼠SCARB2同源性較高，存在抗體交叉結(jié)合現(xiàn)象。Western Blot發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠腦和骨骼肌組織中SCARB2蛋白表達(dá)量高于同窩陰性(圖1C～D)。免疫組化發(fā)現(xiàn)SCARB2蛋白主要分布于轉(zhuǎn)基因小鼠的骨骼肌和腦組織中(圖2A～B，彩插3)，該結(jié)果表明成功建立了腦和肌肉組織表達(dá)人SCARB2蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠。

2.2 SCARB2促進(jìn)EV71感染轉(zhuǎn)基因幼鼠

為研究表達(dá)人SCARB2對EV71感染轉(zhuǎn)基因小鼠的促進(jìn)作用。我們分別用MP10毒株感染不同年齡段的小鼠，發(fā)現(xiàn)兩周齡以下的轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠在感染病毒后，會于10天內(nèi)死亡，肌肉組織內(nèi)病毒載量超過108copy/mg，轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠在病毒復(fù)制方面差別不大。因此，我們用MP10毒株分別感染了21日齡的轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠，主要研究了表達(dá)人SCARB2受體組織內(nèi)的病毒復(fù)制情況。發(fā)現(xiàn)在感染后3天(病毒復(fù)制的最高峰)轉(zhuǎn)基因小鼠骨骼肌和腦中EV71的拷貝數(shù)顯著高于同窩陰性小鼠(圖3A～B)，隨后，用免疫組化研究了組織內(nèi)的病毒分布情況。EV71抗原主要分布于轉(zhuǎn)基因小鼠的腦組織中，而野生型小鼠腦組織中未檢測到病毒抗原(圖4A，彩插3)。轉(zhuǎn)基因小鼠骨骼肌組織內(nèi)均分布著大量的EV71抗原，與和野生型小鼠比兩者間差異明顯(圖4B，彩插3)。表明表達(dá)人SCARB2可促進(jìn)EV71對轉(zhuǎn)基因小鼠組織的感染，證實(shí)該蛋白在體內(nèi)可發(fā)揮EV71受體的功能。

注:A:EV71感染小鼠3天后腦中病毒載量。B:EV71感染小鼠3天后肌肉中病毒載量。*P＜0.05 和 ＊＊P ＜0.001.圖3 EV71感染轉(zhuǎn)基因小鼠Note:A:viral load of brain of E71infected mice at 3 days post infection.B:viral load of muscle of E71infected mice at 3 days post infection.*P ＜0.05 and ＊＊P ＜0.001.Fig.3 EV71 infect transgenic mice

3 討論

目前報(bào)道的人EV71受體有兩種，分別是PSGL-1［13，16］和 SCARB2［15］，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明:EV71 通過分別與這兩個(gè)受體結(jié)合而侵入組織細(xì)胞的。PSGL-1的受體效果曾經(jīng)在體內(nèi)得到初步證實(shí)［19］。SCARB2在許多組織中表達(dá)，有N末端和C末端兩個(gè)跨抹區(qū)參與膜運(yùn)輸。前期研究證實(shí):A，B和C3種亞型的EV71均可使用SCARB2作為受體，在EV71不易感的細(xì)胞系中表達(dá)人SCARB2受體時(shí)可以促進(jìn)EV71感染并引發(fā)細(xì)胞病變［15，17］。

小鼠模型是進(jìn)行EV71感染與致病機(jī)制、藥物和疫苗研究的基本工具，而目前報(bào)道的小鼠模型主要使用兩周齡以下的小鼠，限制了其在基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用。通過表達(dá)人的EV71病毒受體，進(jìn)而提高轉(zhuǎn)基因小鼠對病毒的敏感性，有望建立接近成年小鼠的動物模型。本研究通過將CMV啟動子驅(qū)動的人SCARB2基因插入小鼠基因組中，成功構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因小鼠。人SCARB2基因在小鼠的肌肉和腦組織中均高表達(dá)。隨后，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫組化證實(shí)目的蛋白表達(dá)可促進(jìn)病毒對小鼠的感染和復(fù)制能力，經(jīng)體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí)了目的蛋白的受體功能。同時(shí)，EV71的轉(zhuǎn)基因小鼠模型可作為研究SCARB2蛋白在上述兩個(gè)組織生理和/或病理過程中的生物學(xué)功能的模型工具。

(本文圖2，圖4見彩插3)

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