動物模型評價化妝品原料美白功效的研究

秦 瑤，程樹軍，黃健聰，張俊賓

(1．廣東檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣州 510623;2．廣州市華代生物科技有限公司，廣州 510130)

皮膚美白劑的研發(fā)及其功效評價方法與黑色 素形成生物學(xué)機(jī)制的認(rèn)識密切相關(guān)。近年來，隨著對人體黑色素形成通路、基因調(diào)控、信號傳導(dǎo)等生物學(xué)機(jī)制的深入了解，以及體外培養(yǎng)技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)和皮膚生物物理學(xué)檢測技術(shù)的發(fā)展，美白劑的評價逐漸傾向于采取以機(jī)制為導(dǎo)向的組合評價策略［1］。體外酶抑制法用于原料初篩，細(xì)胞法用于機(jī)制研究和初篩［2］，人體臨床試驗(yàn)用于配方或成品的功效確認(rèn)等［3］。雖然角質(zhì)細(xì)胞攝取試驗(yàn)、3D皮膚模型等新的非整體動物的體外方法在原料篩查階段已得到應(yīng)用［1，4］，但尚不能完全模擬化妝品活性成份在體內(nèi)功效作用的復(fù)雜機(jī)制。動物法能較好地彌補(bǔ)上述幾種方法的不足，基于動物模型的美白評價方法可以在體外初篩的基礎(chǔ)上起到進(jìn)一步明確作用效果的作用［1］，成為整合運(yùn)用體外方法、體內(nèi)動物試驗(yàn)和臨床評估化妝品美白功效的重要環(huán)節(jié)。本文選取花色豚鼠為實(shí)驗(yàn)動物，建立紫外線誘發(fā)皮膚黑化模型，利用皮膚生物物理檢測技術(shù)，結(jié)合組織化學(xué)染色及圖像分析技術(shù)對皮膚內(nèi)的黑素顆粒定量，應(yīng)用于美白化妝品的功效評價。

1 材料和方法

1.1 試劑及配制

L-多巴、白藜蘆醇、熊果苷和戊巴比妥鈉(購自Sigma公司)，氯化金、核固紅、五水合硫代硫酸鈉(均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，硝酸銀(購自天津市贏達(dá)稀貴化學(xué)試劑廠)，伊紅蘇木素試劑盒和中性樹膠封片劑(廣州維格斯生物科技有限公司)，多聚甲醛和氨水(廣州化學(xué)試劑廠)。其余試劑均為市售分析純。白藜蘆醇(RV)，先用乙醇溶解，再用無菌水加溫稀釋，配成終濃度為0.05mM的溶液，熊果苷(AB)，先用無菌水50℃溶解，再配成5 mM的溶液，熊果苷-白藜蘆醇(AR)溶液，上述RV溶液和AB溶液等比例混合。

1.2 儀器設(shè)備

皮膚光毒性試驗(yàn)儀(Hope-med 8130A型，天津合普公司)，膚色測定儀(德國CK公司 mexmeter 18)，生物組織脫水機(jī)(Leica TP 1020)、染色機(jī)(Leica ST 5010)和石蠟切片機(jī)(Leica RM 2255)，顯微鏡及照相系統(tǒng)(德國 Leica DM2000)，Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)(美國Media Cybernetics公司)。動物實(shí)驗(yàn)用斑試器購自廣州國裕醫(yī)學(xué)有限公司，直徑2 cm，容積1 mL。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

普通級健康成年棕黃色Hartly豚鼠，雌性，30只，體重(250±20)g。購自廣東省醫(yī)學(xué)動物中心，動物合格證【SCXK(粵)2008-0002】。實(shí)驗(yàn)在廣東檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心進(jìn)行，使用許可證【SYXK(粵)2008-0086】。

1.4 皮膚黑化模型

隨機(jī)選擇10只豚鼠制作模型，取棕色皮膚部位，去除被毛，經(jīng)UVB紫外線照射，波長為310 nm，累計照射總量5000 mJ/cm2。每天照射1次，每次1 h，持續(xù)7 d，未照射部位以斑試器覆蓋。定時檢測皮膚MI和EI指數(shù)，停止照射7 d后，處死動物取皮膚組織。

1.5 原料美白作用評價

20只動物隨機(jī)分為2組，美白劑組10只，空白對照組10只。美白劑組先經(jīng)紫外線照射成皮膚黑化模型，在每只豚鼠背部取相對獨(dú)立的4塊區(qū)域作為給藥區(qū)，分別為AB組、RV組、AR組和對照組。取封閉式斑試器，將受試物約(0.8±0.2)mL置于斑試器內(nèi)，與皮膚直接接觸，固定斑試器，敷用時間為6 h，試驗(yàn)結(jié)束后用溫水清除殘留受試物。模型對照區(qū)域每次涂抹0.9%生理鹽水1 mL。連續(xù)給藥5周，安樂處死動物后取皮膚組織。

1.6 皮膚顏色測定

造模前、造模后、試用產(chǎn)品前及使用產(chǎn)品后用mexmeter儀檢測紅色素指數(shù)(EI)和黑色素指數(shù)(MI)，基于單光譜反射和吸收的原理，獲得皮膚EI和MI含量數(shù)據(jù)。

1.7 組織學(xué)染色

所取皮膚組織經(jīng)10%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟切片，分別進(jìn)行如下組織化學(xué)染色。L-多巴染色:切片經(jīng)脫蠟處理，0.1%L-多巴溶液中37℃浸泡4 h，鏡下觀察染色變化，PBS沖洗，蒸餾水沖洗，HE復(fù)染。Fontana-Masson氨銀染色:切片經(jīng)脫蠟處理和水洗后，置于氨銀溶液中，60℃水浴放置60 min，用0.1%氯化金染色10 min，去離子水沖洗，再用5%Na2S2O3溶液浸泡5 min，分別用自來水和去離子水沖洗，最后用0.2%核固紅染色5 min，去離子水沖洗。常規(guī)脫水，二甲苯透明和中性樹膠封片。

1.8 圖像分析

對染色后組織學(xué)切片進(jìn)行顯微拍照，采用Image-Pro Plus 6.0分析軟件對圖像進(jìn)行如下分析。參考文獻(xiàn)對L-多巴染色的黑色顆粒進(jìn)行分級［5］，1級:基底細(xì)胞和棘層偶見黑素顆粒;2級:黑素顆粒分布以基底層為主，且分布不連續(xù);3級:基底細(xì)胞和棘層均可見呈連續(xù)帶狀分布的黑素顆粒;4級:基底細(xì)胞和棘層可見大量呈連續(xù)帶狀分布的黑素顆粒，且角質(zhì)細(xì)胞內(nèi)可見較多黑素帽(附著于細(xì)胞核的黑素顆粒呈帽狀);5級:表皮全層密布黑素顆粒，可見較多黑素帽。參考文獻(xiàn)對氨銀染色的組織切片進(jìn)行光密度分析［6］，并作修改。光密度/黑色素細(xì)胞面積(L/M):指黑素顆粒占黑色素細(xì)胞面積的百分率，表明黑色素細(xì)胞內(nèi)黑素顆粒的含量。光密度/表皮細(xì)胞面積(L/K):指黑素顆粒占表皮角質(zhì)層細(xì)胞面積的百分率，表明黑素顆粒遷移到角質(zhì)層的含量。光密度/表皮層面積(L/E):指黑素顆粒占全部表皮層的面積的百分率，表明黑素顆粒在表皮中的含量。每個樣品隨機(jī)拍攝30張照片進(jìn)行處理和分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紫外線皮膚黑化模型

紫外線照射前后，膚色測定和多巴染色、氨銀染色結(jié)果見表1。棕色皮膚經(jīng)UVB照射后，MI顯著升高，EI指數(shù)明顯下降。組織化學(xué)染色顯示黑素含量均明顯增大，黑素顆粒染分級接近5級。L/M、L/K和L/E的值照射前后相比均具有顯著性差異。表明采用累計總量達(dá)5000 mJ/cm2左右的UVB照射，可以造成豚鼠皮膚黑化模型。

2.2 美白功效比較

紫外線造模后皮膚分別涂抹熊果苷(AB)、白藜蘆醇(RV)和熊果苷-白藜蘆醇復(fù)配物(AR)，皮膚顏色指數(shù)測定、L-多巴染色黑素顆粒分級和氨銀染色圖像分析結(jié)果見表2。L-多巴和氨銀組織化學(xué)染色見圖1和圖2(圖1，圖2，彩插5)。

皮膚顏色測試表明，美白劑組與模型組比較，MI明顯降低，EI明顯升高，復(fù)合化合物組(AR)比單一AB組和RV組皮膚MI下降更顯著。RV對EI指數(shù)的改善較MI指數(shù)明顯，提示RV對紅色素提升效果優(yōu)于AB。黑素顆粒分級結(jié)果表明AR組分級明顯下調(diào)。

表1 UVB照射前后皮膚測試結(jié)果比較Tab．1 Skin test results compared before and after irradiation

表2 不同美白劑配方效果比較Tab．2 Compare the effect of different whitening agent

組織化學(xué)圖像分析表明，美白劑組與模型組相 比，皮膚內(nèi)黑素含量顯著降低，L/M、L/E、和L/K均有不同程度下降，統(tǒng)計數(shù)據(jù)具有顯著性差異，以AR組各指標(biāo)下降最為顯著。相比之下，AB組對L/M的下降較RV組明顯，而RV對L/E和L/K的影響較顯著。提示使用白藜蘆醇30 d后，對表皮細(xì)胞內(nèi)黑色素顆粒的含量影響較顯著，而AB對黑色細(xì)胞內(nèi)顆粒的合成影響較明顯。

3 討論

利用動物模型研究美白劑的功效和作用機(jī)制是美白產(chǎn)品研發(fā)的重要依據(jù)，本文利用紫外線造成豚鼠皮膚黑化模型，運(yùn)用皮膚臨床檢測、組織化學(xué)染色及圖像分析等多種技術(shù)手段研究美白劑的功效，把臨床監(jiān)測和組織學(xué)顯微分析相結(jié)合，提高了動物模型的使用效率。

把無創(chuàng)性皮膚定量檢測儀用于動物皮膚顏色變化的檢測，提供了一種客觀動態(tài)的評價方法，但與人體臨床試驗(yàn)一樣，也應(yīng)保持檢測環(huán)境的恒溫、恒濕和光線穩(wěn)定［3］。利用圖像分析軟件對組織切片進(jìn)行黑素顆粒分級和黑素含量分析應(yīng)控制染色的質(zhì)量和不同染色方法之間的對比。本文觀察了兩種染色方法對檢測結(jié)果的影響，結(jié)果表明，組合染色法能對不同美白劑之間的效果差異較好地區(qū)分，復(fù)合使用熊果苷-白藜蘆醇，能顯著提高美白效果，所得結(jié)果均具有顯著性差異。L-多巴染色適合黑素顆粒的分級，該方法利用黑素細(xì)胞內(nèi)的多巴氧化酶對多巴氧化進(jìn)行染色，而多巴氧化酶特異性地存在于黑素細(xì)胞內(nèi)，劉榮等認(rèn)為多巴染色法的特異性和靈敏度更高一些［6］。氨銀染色法是因?yàn)楹谒鼐哂羞€原性，能將氧氧化銀氨液內(nèi)的銀離子還原成金屬銀而成黑色，適合對整張切片的光密度進(jìn)行分析。這兩種方法的缺點(diǎn)是特異性不強(qiáng)，近年來，分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，多種美白劑和抗氧化劑與黑色素形成中的MITF、HMB45等有關(guān)，因此，如果補(bǔ)充MITF、S100以及HMB45等表征黑色素細(xì)胞的特異標(biāo)志物的免疫組化方法可提高動物模型應(yīng)用于作用機(jī)制的研究［7］。

人體皮膚黑色素的形成是一個非常復(fù)雜的生物學(xué)過程，由于不同美白劑的作用機(jī)制差異很大，不同試驗(yàn)體系獲得的結(jié)果可能存在差異［8］。如體外蘑菇酪氨酸酶測試白藜蘆醇抑制活性是曲酸的40倍，小鼠B16細(xì)胞的研究也表明白藜蘆醇去色素效果可能與其抑制MITF和酪氨酸酶啟動子活性有關(guān)［2］，但用正常人黑色素細(xì)胞沒有得出相同的研究結(jié)論［9］。白藜蘆醇經(jīng)證實(shí)的主要生物學(xué)作用是下調(diào)血管活性肽(如內(nèi)皮縮血管肽 ET-1)活性［10］，而ET-1是重要的促黑素合成和黑素細(xì)胞增生的分裂原。RV還可調(diào)節(jié)凋亡信號通路，對抗因紫外線照射誘發(fā)皮膚細(xì)胞內(nèi)自由基升高引起的損傷作用［11］。經(jīng)研究證實(shí)白藜蘆醇對表皮細(xì)胞的保護(hù)作用是通過與表皮細(xì)胞膜特異性的多酚受體結(jié)合［12］，而對黑色素細(xì)胞的作用是直接抑制其活性而不影響其基因表達(dá)。熊果苷雖是氫醌的衍生物，其細(xì)胞毒性較氫醌低，是公認(rèn)的抑制黑色素合成和轉(zhuǎn)運(yùn)的化合物，它通過競爭性和可逆性地與酪氨酸酶結(jié)合而抑制黑色素的形成，并不影響酪氨酸酶的RNA轉(zhuǎn)錄［13］，而且高劑量使用反而可能引起黑色素的異常增生，因而其在產(chǎn)品中的使用濃度通?？刂圃?%以內(nèi)。本文研究表明，單純使用白藜蘆醇對于皮膚的美白效果不如熊果苷，采用二者聯(lián)合復(fù)配，不僅可降低熊果苷的使用濃度，而且美白效果有顯著提高，紅細(xì)胞指數(shù)明顯上升，表皮細(xì)胞內(nèi)黑素顆粒下降明顯。提示在膚色變白的同時，復(fù)配后通過血紅素的變化間接影響膚色。推測白藜蘆醇所起作用可能與對抗因紫外線造成的氧化應(yīng)激和自由基損傷，緩解毛細(xì)血管緊張程度和抑制黑素顆粒向表皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。

從天然植物中開發(fā)化妝品活性原料已成為一種潮流［14］，而且多種生物活性物質(zhì)配合使用可明顯相互促進(jìn)各自本身的功效，如防曬產(chǎn)品中添加保濕劑提高防曬指數(shù)，美白產(chǎn)品中添加抗氧化劑提高美白功效等［15］。本研究結(jié)果也表明，復(fù)合使用熊果苷-白藜蘆醇能顯著提高美白效果，使組織中的黑素顆粒生成和分布明顯減少。本研究表明使用動物模型試驗(yàn)對于整體水平美白功效評價是有價值的，為下一步人體臨床試驗(yàn)確認(rèn)美白效果提供依據(jù)。

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