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    環(huán)境污染物As及SHP2D61G/+激活對(duì)小鼠成纖維母細(xì)胞miRNA表達(dá)譜的影響

    2013-11-27 05:27:06崔花芹汪心怡瞿成奎汪思應(yīng)
    關(guān)鍵詞:基因突變環(huán)境污染雜交

    崔花芹,汪心怡,陳 吉,陳 卓,趙 華,瞿成奎,3,汪思應(yīng)

    (1.安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,合肥 230032;2.安徽醫(yī)科大學(xué)臨床學(xué)院,合肥 230032;3.Case Western Reserve University,Cleveland,USA,44106)

    近年來(lái),我國(guó)腫瘤發(fā)病呈現(xiàn)明顯的高發(fā)早發(fā)趨勢(shì),懷疑系環(huán)境污染及基因突變相互作用的結(jié)果。一方面環(huán)境污染通過(guò)引發(fā)基因突變致癌,另一方面,基因突變的機(jī)體可能對(duì)環(huán)境污染更加敏感而易發(fā)生腫瘤。環(huán)境污染物有很多種,其中包括因采礦、廢氣污染、污水灌溉及使用重金屬制品導(dǎo)致的重金屬污染[1]。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查,我國(guó)水源污染物中砷和鎘排在首位。重金屬污染物主要通過(guò)氧化應(yīng)激,激活 NF-κB、AP-1、HIF-1 等的信號(hào)分子及氧化損傷造成基因突變,導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化,促發(fā)腫瘤,基因突變也可能通過(guò)信號(hào)途徑異?;罨斑z傳不穩(wěn)定性導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化促發(fā)腫瘤[2]。但這些僅僅初步解釋了腫瘤高發(fā)的一些問(wèn)題,對(duì)于腫瘤早發(fā)并沒(méi)有答案。我們推斷:環(huán)境污染促發(fā)基因突變,而攜帶基因突變的細(xì)胞或機(jī)體對(duì)環(huán)境污染更加敏感,可能是促進(jìn)腫瘤早發(fā)的主要原因。我們前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)SHP-2激活突變的細(xì)胞在重金屬污染物誘導(dǎo)下,更容易發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化,攜帶SHP-2激活突變的小鼠在環(huán)境因素誘導(dǎo)下更易發(fā)生腫瘤[3]。SHP-2是一個(gè)含有兩個(gè)SH2結(jié)構(gòu)域的酪氨酸磷酸酶,在各組織中廣泛表達(dá),被激活時(shí),活化的蛋白通過(guò)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)與SH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合或C端的2個(gè)酪氨酸位點(diǎn)磷酸化活化結(jié)合自身的SH2結(jié)構(gòu)域發(fā)揮活性[4,5],影響NF-кB、JAK-START、PI3K 等信號(hào)途徑。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)SHP2多種激活突變參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6-8]。但激活突變SHP2與環(huán)境污染污染物聯(lián)合協(xié)同作用的機(jī)制不清,闡明之有助于解決腫瘤高發(fā)和早發(fā)問(wèn)題。但腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制很復(fù)雜,其中miRNA是新近發(fā)現(xiàn)的可能參與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病發(fā)生發(fā)展的主要分子之一,miRNA也就是通常所說(shuō)的微小核糖核甘酸,是一類(lèi)非編碼的單鏈RNA,大約含有18~25個(gè)核苷酸[9]。研究發(fā)現(xiàn),它主要是通過(guò)與靶mRNA的3’-UTR區(qū)完全或部分結(jié)合從而使靶基因降解或沉默,進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展,發(fā)揮了類(lèi)似于癌基因或抑癌基因的作用,同一個(gè)miRNA可能同時(shí)調(diào)控幾個(gè)不同的mRNA,同一個(gè)mRNA也可以受到幾個(gè)不同的miRNA的調(diào)節(jié),類(lèi)似于基因密碼子的匹配機(jī)制,因此,人體內(nèi)大約有30%的蛋白受到miRNA的調(diào)控,在細(xì)胞內(nèi)形成了一個(gè)非常大的網(wǎng)絡(luò)[10],MiRNA的發(fā)現(xiàn)為腫瘤的研究提供了一個(gè)新視野,很多研究發(fā)現(xiàn),microRNAs與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡及遷移等都有著密切的關(guān)系[11],miRNAs異常表達(dá)可能參與了環(huán)境因素促發(fā)腫瘤的過(guò)程。因此,本研究為了初步探測(cè)miRNAs在腫瘤形成中的作用,建立了環(huán)境及基因突變的MEFs細(xì)胞,基因芯片技術(shù)檢測(cè)砷處理48h后的MEFs細(xì)胞和SHP2D61G/+突變的MEFs細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜,探討miRNAs表達(dá)變異情況,并選取兩個(gè)變異趨勢(shì)隨砷處理和基因突變一致的兩個(gè) miRNA做 RT-PCR檢測(cè),發(fā)現(xiàn)mmu-miRNA-100的表達(dá)隨處理遞減;mmu-miRNA-1907的表達(dá)隨處理遞增,為我們進(jìn)一步研究miRNA在致瘤中的機(jī)制做準(zhǔn)備。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 試劑與儀器

    DMEM、FBS(均為 GIBCO公司生產(chǎn),美國(guó))、三氧化二砷(為Sigam公司生產(chǎn),美國(guó))、RT-PCR試劑盒、引物(為上海吉瑪公司生產(chǎn),中國(guó)上海)、總 RNA提取試劑 和Trizol(為Invitrogen公司生產(chǎn),美國(guó))、倒置顯微鏡(Olympus IX71,日本)、CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermos公司,美國(guó))。

    1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    SPF級(jí)C57BL/6品系SHP2D61G/+小鼠,6周齡,雌/雄,體重18~20 g,美國(guó) Case Western Reserve大學(xué)瞿成奎教授贈(zèng)送,由安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心繁育【SCXK(皖)2011-002】,在安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心無(wú)特定病原體(specific-pathogen free,SPF)的飼養(yǎng)間【SYXK(皖)2011-007】飼養(yǎng),所有實(shí)驗(yàn)操作程序均經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用管理委員會(huì)批準(zhǔn)(LLSC211-002)。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

    MEFs細(xì)胞以DMEM+10%FBS培養(yǎng),培養(yǎng)基內(nèi)含100IU/mL青霉素和鏈霉素,細(xì)胞在5%CO2,37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

    1.2.2 MEFs細(xì)胞建立及永生化

    取雌雄小鼠合籠交配,第二天早上觀(guān)察雌鼠的陰道口,若有陰道栓表明已懷孕0.5 d,待胚胎6.5 d后解剖雌鼠,在超凈臺(tái)操作,以高壓滅菌的PBS清洗分離胚胎,制備胚胎組織塊,分別接種不同的培養(yǎng)皿,細(xì)胞在10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中,37℃,5%CO2培養(yǎng)24 h,SHP2+/+MEF即組織周?chē)煺股L(zhǎng)出的細(xì)胞,留取細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)并以SV40T抗原進(jìn)行永生化備用;SHP2D61G/+MEFs細(xì)胞制備方法類(lèi)似:取雌雄SHP2D61G/+小鼠合籠交配,同樣的分離6.5 d的胚胎,制備組織塊接種不同的細(xì)胞培養(yǎng)皿,并且留取部分組織做基因型鑒定,根據(jù)基因型鑒定結(jié)果留取SHP2D61G/+的MEFs細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)并以SV40T抗原進(jìn)行永生化備用。

    1.2.3 重金屬化合物As2O3處理MEFs細(xì)胞

    美國(guó)是教育強(qiáng)國(guó),其藥學(xué)教育也處于世界領(lǐng)先地位,美國(guó)的藥學(xué)教育研究一直為其他國(guó)家所借鑒。在英國(guó)教育升學(xué)組織(Quacquarelli Symonds,QS)2018年公布的世界藥學(xué)與藥理學(xué)學(xué)科前300名中,有70所美國(guó)高校上榜[1]。本文通過(guò)對(duì)近5年的《美國(guó)藥學(xué)教育雜志》進(jìn)行文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì),了解其主要研究?jī)?nèi)容、研究現(xiàn)狀及研究方法,為我國(guó)高等藥學(xué)教育研究的發(fā)展提供參考與借鑒。

    取1×106對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的MEFs細(xì)胞接種于75 cm2培養(yǎng)瓶,待細(xì)胞貼壁后,以 0.5 μmol/L As2O3處理48 h,以PBS洗三遍,加胰酶消化細(xì)胞,待細(xì)胞變圓后加入細(xì)胞培養(yǎng)基終止消化,吹打細(xì)胞后收集至離心管中900 r/min離心,棄上清,以PBS沖洗三次。以Trizol試劑盒提取細(xì)胞及組織總RNA,1 mL的Trizol裂解1×107個(gè)細(xì)胞,之后,在1 mL的Trizol中加入 200 μL 氯仿,震蕩 10 s,冰置 3 min,4℃,12000 r/min離心10 min,小心吸取上層水相至1.5 mLEP管中,加等量或稍多的異丙醇,輕輕顛倒混勻3 次,冰置10 min,4℃,12000 r/min 離心10 min,棄上清,加75%乙醇,4℃,7500 r/min離心15 min,棄上清,75%乙醇重復(fù)洗滌一次,棄上清,室溫晾約5 min,加入約50 μL DEPC水冰上溶解,紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度,-80℃保存。

    1.2.4 miRNA芯片雜交分析

    因?yàn)閙iRNA僅含有二十個(gè)堿基左右,特異性很高,因此,每個(gè)miRNA需用兩條引物才能識(shí)別,每條引物只能識(shí)別miRNA序列的一半,一條引物攜帶標(biāo)示序列Tag,另一條引物攜帶T7啟動(dòng)子序列,只有兩條序列都與miRNA完全匹配才能形成RNA/DNA雜合體。之后,以磁珠分離出RNA/DNA雜合體,在T4連接酶的作用下,連接為一個(gè)DNA片段再轉(zhuǎn)錄,轉(zhuǎn)錄的RNA序列再與含有不同miRNA序列的膜雜交,加入含有辣根過(guò)氧化物酶HRP的親和素反應(yīng),最后加入發(fā)光底物進(jìn)行測(cè)定。

    1.2.5 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RT-PCR

    以吉瑪提供的 MiR-RT primers引物、2 μL RNA、4 μL RT Buffer、0.75 μL dNTP、0.2 μLMMLV或AMV、DEPC水配成20 μL反應(yīng)體系,反應(yīng)條件為16℃,30 min,42℃,30 min,85℃,10 min,逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物保存在-20℃。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋3~4倍后取2 μL 或4 μL 作為模板,作體系為20 μL 或40 μL 的PCR反應(yīng),20 μL體系的反應(yīng)混合物包含2×PCR Buffer 10 μL、miR specific Primer set(5 μM)0.35 μL、miRNA RT product、2 μL、Taq DNA polymerase(5 u/μL)0.2 μL、加 ddH2O 至 20 μL。反應(yīng)條件為:95℃變性3 min后,95℃,12 s,62℃,50 s,40 個(gè)循環(huán),5%TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

    1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析

    SPASS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±S)表示,每個(gè)試驗(yàn)指標(biāo)均重復(fù)3次,數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,以P<0.05為差異顯著。

    2 結(jié)果

    2.1 miRNA芯片雜交分析 As2O3對(duì) SHP2+/+MEFs細(xì)胞miRNA表達(dá)譜的影響

    2.2 miRNA芯片雜交分析As2O3對(duì)SHP2D61G/+MEFs miRNA表達(dá)譜的影響

    收集 0.5 μmol/L As2O3處理 48 h的 SHP-2D61G/+突變的 MEFs細(xì)胞,提取總 RNA,做 miRNAs芯片雜交分析,觀(guān)察miRNAs表達(dá)譜變化情況,篩選出表達(dá)差異明顯者,并選取二十個(gè)變異明顯的miRNAs做前期報(bào)道,如圖2所示,20個(gè)miRNA表達(dá)出現(xiàn)明顯變化,且變異亦皆在兩倍以上。

    圖1 miRNAs表達(dá)譜芯片雜交分析結(jié)果Fig.1 The result of miRNAs expression profiling of SHP2+/+MEFs

    圖2 miRNAs表達(dá)譜芯片雜交分析結(jié)果Fig.2 The result of miRNAs expression profiling of SHP2D61G/+MEFs

    2.3 受環(huán)境因素和基因因素影響一致的miRNAs

    在對(duì)miRNAs表達(dá)譜進(jìn)行分析的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)有的miRNA在三氧化二砷誘導(dǎo)和基因突變影響下出現(xiàn)一致的變化,如圖3,在 SHP2+/+MEFs、SHP2+/+MEFs+As、SHP2D61G/+MEFs、SHP2D61G/+MEFs+As四種細(xì)胞中mmu-miR-100表達(dá)遞減,mmu-miR-1907表達(dá)遞增。

    2.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RT-PCR檢測(cè)mmu-miRNA-100和mmu-miRNA-1907表達(dá)

    圖3 miRNAs變異趨勢(shì)分析Fig.3 The analysis of miRNAs trend

    提取 SHP2+/+MEFs、SHP2+/+MEFs+As、SHP2D61G/+MEFs、SHP2D61G/+MEFs+As 四種細(xì)胞的總RNA,不同的引物擴(kuò)增 mmu-miR-100和 mmumiR-1907,以5%的瓊脂糖凝膠電泳拍照分析,如圖4,mmu-miRNA-100 表 達(dá) 在 SHP2+/+MEFs、SHP2+/+MEFs+As、SHP2D61G/+MEFs、SHP2D61G/+MEFs+As四種細(xì)胞中表達(dá)遞減,mmu-miRNA-1907表達(dá)遞增。

    3 討論

    腫瘤是近幾年的一個(gè)研究熱點(diǎn),是一類(lèi)嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的疾病,全世界每年有癌癥病人約4500萬(wàn),新發(fā)病例1300萬(wàn),每年因癌癥死亡的約800萬(wàn),我國(guó)的癌癥發(fā)病率居世界第二[12]。腫瘤從本質(zhì)上說(shuō)是細(xì)胞的基因失去對(duì)正常生長(zhǎng)和凋亡控制導(dǎo)致的異常增生,據(jù)衛(wèi)生部統(tǒng)計(jì)顯示,我國(guó)惡性腫瘤發(fā)病率一直呈上升趨勢(shì),患病人數(shù)不斷增加,且有年輕化的趨勢(shì),對(duì)人類(lèi)健康的危害極大,因此,探討腫瘤發(fā)生機(jī)制是醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)問(wèn)題。

    諸多研究表明,腫瘤發(fā)生是環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的結(jié)果,其中環(huán)境因素主要包括環(huán)境污染和不良生活習(xí)慣等,環(huán)境因素中的某些有害物質(zhì)如重金屬污染物、尼古丁和酒精等可通過(guò)誘發(fā)機(jī)體的氧化應(yīng)激,產(chǎn)生大量氧自由基,損傷細(xì)胞遺傳物質(zhì),激活體內(nèi)某些信號(hào)途徑,導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖和凋亡障礙[13,14]。隨著現(xiàn)代化進(jìn)程的加速,環(huán)境污染日益嚴(yán)重,人們的面臨的生活壓力和生活習(xí)慣也發(fā)生了重大變化,致使腫瘤發(fā)病率不斷提高,但腫瘤早發(fā)的原因并不清楚,我們推斷:一方面環(huán)境污染通過(guò)促進(jìn)基因突變致瘤,另一方面基因突變的機(jī)體或?qū)Νh(huán)境因素更加敏感,可能是導(dǎo)致腫瘤發(fā)病人群年輕化的主要原因,對(duì)于探討腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制意義重大。

    圖4 RT-PCR結(jié)果分析Fig.4 The results of RT-PCR analysis

    MicroRNA是人類(lèi)基因組計(jì)劃實(shí)施以來(lái)作為基因非編碼序列一員受到最多關(guān)注的一個(gè),最早發(fā)現(xiàn)的 miRNA 是在線(xiàn)蟲(chóng)中的 let-4和 let-7[15,16]。自被發(fā)現(xiàn)以來(lái),諸多研究者通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)上千種miRNA。MiRNA表達(dá)上具有階段性和組織特異性,這種特異性對(duì)機(jī)體正常生長(zhǎng)發(fā)育起到重要調(diào)節(jié)作用,對(duì)發(fā)揮其自身的調(diào)控作用也意義重大[17],研究表明,它與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān),如白血病、乳腺癌、宮頸癌等[18]。MiRs主要是通過(guò)與靶 mRNA的3’-UTR區(qū)完全或部分互補(bǔ)結(jié)合從而使靶基因降解或沉默,進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展,發(fā)揮了類(lèi)似癌基因或抑癌基因作用。MiRs與多條信號(hào)通路密切相關(guān),比如重要的抑癌基因P53,又如細(xì)胞抗凋亡BCL-2蛋白家族等[19]。在我們的研究中,首先是以miRNA芯片雜交技術(shù)篩選出數(shù)十種變異明顯的miRNA,并分析變化趨勢(shì),有的miRNA在SHP2+/+MEFs、SHP2+/+MEFs+As、SHP2D61G/+MEFs、SHP2D61G/+MEFs+As四種細(xì)胞中呈現(xiàn)一致的變化趨勢(shì),如 mmu-miR-100表達(dá)逐漸減少、mmu-miR-1907表達(dá)逐漸增多,通過(guò)RT-PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證得到的結(jié)果與芯片雜交分析結(jié)果一致,驗(yàn)證了芯片雜交結(jié)果的可靠性。

    三氧化二砷處理的 SHP2+/+MEFs細(xì)胞和SHP2D61G/+MEFs細(xì)胞中變化趨勢(shì)一致的兩個(gè)miRNA(mmu-miRNA-100、mmu-miRNA-1907),其生物學(xué)功能在國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中都尚未報(bào)道,這是我們尋找參考資料的一個(gè)難點(diǎn),同時(shí)也是我們研究的一個(gè)創(chuàng)新所在,我們將通過(guò)生物學(xué)信息預(yù)測(cè)及熒光素酶報(bào)告基因等方法尋找其作用靶點(diǎn),探討它們所參與的信號(hào)通路,進(jìn)一步了解它們?cè)诩?xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為中發(fā)揮的作用。此外,我們將探討這兩個(gè)miRNA在臨床病人癌組織相對(duì)癌旁組織中的表達(dá)差異,對(duì)其在人類(lèi)腫瘤發(fā)生中的作用進(jìn)行驗(yàn)證,闡明它們?cè)谀[瘤形成、發(fā)展中的作用及機(jī)制,使得本文的研究有所新發(fā)現(xiàn)。

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