循環(huán)次數(shù)與體系對DNA檢測靈敏度的影響

張 璐 ，王保捷 ，丁 梅 ，林子清 ，龐 灝 ，邢佳鑫 ，宣金鋒

（1．中國醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽 110001；2．中國刑事警察學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，遼寧 沈陽 110035）

隨著DNA檢驗(yàn)鑒定技術(shù)的日益完善，檢測的靈敏度也顯著提高，使微量DNA的檢驗(yàn)從μg級發(fā)展到ng 級以下的水平[1]，低拷貝模板（low copy number，LCN）即小于100pg的DNA也可成功分析[2]。對微量DNA檢驗(yàn)?zāi)芰Φ奶岣撸乖S多微量DNA檢材在偵查破案中發(fā)揮了應(yīng)有的價(jià)值。本研究探討增加PCR循環(huán)次數(shù)和縮小擴(kuò)增體系是否可以改善DNA檢驗(yàn)的靈敏度，希望實(shí)現(xiàn)對極微量DNA樣品的正確分型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣本

采集10例中國漢族無血緣關(guān)系健康志愿者個(gè)體精液樣本，所有樣本提供者均已簽署知情同意書。

1.2 試劑與儀器

PP16HS試劑盒、等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物（美國Promega公司），9947A對照DNA、去離子甲酰胺（美國AB公司）等。

3130遺傳分析儀、7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國AB公司），ACB-6A1超凈工作臺(tái)（新加坡ESCO公司），Biofuge pico離心機(jī)（德國 Heraeus公司）。

1.3 DNA提取

所有檢材均按GA/T 383—2002《法庭科學(xué)DNA實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)范》中規(guī)定的Chelex法提取DNA。將每份樣本分別定量為 50、40、30、25、20、15、10 pg/μL備用。

1.4 PCR擴(kuò)增

1.4.1 陽性對照9947A不同體系擴(kuò)增

在不同 PCR 擴(kuò)增體系（10、5、3μL）下，分別應(yīng)用PP16HS試劑盒檢測15個(gè)STR基因座，PCR反應(yīng)在7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行，循環(huán)次數(shù)為28次，體系的組成和循環(huán)條件按操作手冊完成。

1.4.2 待檢樣本不同體系擴(kuò)增

在不同 PCR 擴(kuò)增體系（10、5、3μL）下，待檢樣本（50、40、30、25、20、15、10pg/μL）按照 1.4.1 進(jìn)行擴(kuò)增，循環(huán)次數(shù)為28次，樣本加樣量為1μL。

1.4.3 增加循環(huán)次數(shù)擴(kuò)增

1.4.2中未完全檢出的待檢樣本將循環(huán)次數(shù)分別增加到30、32、34和36次進(jìn)行擴(kuò)增。

1.5 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)3130遺傳分析儀電泳分離和激光掃描分析，用3130 Data Collection v3.0軟件收集電泳信息，GeneMapper ID v3.2軟件分析擴(kuò)增片段大小，獲得STR分型結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 陽性對照9947A不同體系擴(kuò)增檢測結(jié)果

陽性對照9947A不同體系擴(kuò)增檢測分型結(jié)果、峰高、峰面積相同。

2.2 待檢樣本不同體系擴(kuò)增檢測結(jié)果

28次循環(huán)條件下，50 pg/μL樣本在 3個(gè)體系（10、5、3μL）均可正確分型，且隨擴(kuò)增體系的減小，峰高明顯增加；40 pg/μL樣本在10 μL體系時(shí)開始有等位基因缺失，在 5、3μL 體系可完全檢出；30、25、20、15、10 pg/μL 樣本在 3 個(gè)體系（10、5、3 μL）中均有不同程度的等位基因缺失。

2.3 增加循環(huán)次數(shù)不同體系擴(kuò)增檢測結(jié)果

在 3 個(gè)體系（10、5、3 μL）中，30、32、34 次循環(huán)條件下 40、30、25、20 pg/μL 樣本可以全部檢出；15、10 pg/μL樣本均出現(xiàn)等位基因缺失現(xiàn)象（圖1～2）。36次循環(huán)條件下，3個(gè)體系中各質(zhì)量濃度的樣本均出現(xiàn)非特異峰，不能正確判型。

圖1 3μL體系20pg/μL樣本34次循環(huán)可以全部檢出

圖2 3μL體系15pg/μL樣本34次循環(huán)存在等位基因缺失

3 討 論

PCR技術(shù)雖已解決了微量DNA的檢測鑒定問題[3]，但法醫(yī)物證工作者一直在尋求進(jìn)一步提高檢測敏感度的方法。擴(kuò)增體系減小后DNA的質(zhì)量濃度提高，DNA分子碰撞的概率增加，使PCR反應(yīng)更容易進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，縮小擴(kuò)增體系可以提高檢測的敏感度，3μL體系可以對40pg/μL及其以上的樣本正確分型。

理論上增加循環(huán)次數(shù)可以提高擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)量，循環(huán)次數(shù)可由28次增加至32～34次[2]。在本實(shí)驗(yàn)中，20pg/μL的樣本在10、5和3μL體系中經(jīng)34次循環(huán)后均可正確分型，進(jìn)一步降低樣本量出現(xiàn)譜帶丟失，但當(dāng)循均次數(shù)增加到36次時(shí)，非特異譜帶出現(xiàn)，無法正確判型。結(jié)果表明，適當(dāng)增加循環(huán)次數(shù)可以提高對樣本的PCR檢測敏感度。雖然20pg/μL的DNA相當(dāng)于3個(gè)體細(xì)胞或6個(gè)精子細(xì)胞的核DNA量，但不一定含有完整的3個(gè)體細(xì)胞或6個(gè)精子細(xì)胞核DNA。常規(guī)DNA制備技術(shù)提取的DNA樣本，檢測量降低的情況下，細(xì)胞捕獲技術(shù)將具有良好的前景[4]。STR的原理決定了PCR時(shí)會(huì)擴(kuò)增出錯(cuò)誤的譜帶，當(dāng)樣本量少時(shí)，錯(cuò)誤譜帶的相對含量會(huì)較高，過多地增加循環(huán)次數(shù)會(huì)增加錯(cuò)誤譜帶出現(xiàn)的可能性，從而影響對譜型的分析。

[1]鄭秀芬.法醫(yī)DNA分析[M].北京：中國人民公安大學(xué)出版社，2002：37-59.

[2]Gill P，Whitaker J，F(xiàn)laxman C，et al.An investigation of the rigor of interpretation rules for STRs derived from less than 100 pg of DNA[J].Forensic Sci Int，2000，112（1）：17-40.

[3]胡蘭.法醫(yī)遺傳學(xué)進(jìn)展與應(yīng)用[M].北京：群眾出版社，2008：29-32.

[4]Vandewoestyne M，Deforce D.Laser capture microdissection in forensic research：a review[J].Int J Legal Med，2010，124（6）：513-521.