響應(yīng)面分析法優(yōu)化草魚的干腌工藝

高 娟，朱凱悅，武晉先，李苗苗，張進(jìn)杰

（寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江寧波315211）

食鹽腌制是最古老的進(jìn)行食品保藏的方法之一，食鹽腌制包括腌漬和熟化兩個階段。腌漬就是食品與固體的食鹽接觸或浸于食鹽水中，食鹽向食品中滲入，同時一部分水分從食品中除去。從而使食品的水分活度降低，以達(dá)到抑制腐敗變質(zhì)的作用[1]。臘魚風(fēng)味獨(dú)特，是我國一種重要的傳統(tǒng)食品，其生產(chǎn)工藝主要包括腌漬和干燥成熟兩個階段。腌漬過程中由于食鹽溶液的滲透作用，魚肉中的氯化鈉含量不斷增加，而其中的鹽溶性蛋白等逐漸滲入鹽鹵中，導(dǎo)致鹽鹵中蛋白質(zhì)含量提高。腌制期間魚肉蛋白質(zhì)變性影響腌魚制品的口感和品質(zhì)。有關(guān)魚肉腌制期間肌肉和鹽鹵生化成分及肌肉蛋白質(zhì)等特性變化的研究，目前文獻(xiàn)報(bào)道不是很多。Sannaveerappa等[2]研究了遮目魚濕腌和干腌過程中與蛋白質(zhì)有關(guān)的化學(xué)變化；譚汝成等[3]研究了濕腌時魚肉與鹽鹵成分的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)降低腌制溫度，縮短腌制時間和提高鹽水濃度可降低魚肉中氯化鈉的含量，控制肌肉中營養(yǎng)成分析出；楊文鴿等[4]對濕腌海鰻工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，魚肉腌制時鹽水濃度對鰻鲞感官評定結(jié)果的影響極顯著，鰻魚肉濕腌的最適鹽度為13.50%；陳麗嬌等[5]利用正交實(shí)驗(yàn)確定大黃魚的腌制工藝參數(shù)。制品的品質(zhì)與其腌制工藝密切相關(guān)。章銀良和夏文水[1，6]研究了海鰻鹽漬過程中的滲透脫水規(guī)律以及海藻糖對鹽漬海鰻機(jī)動球蛋白的影響，結(jié)果表明，添加2.90%的海藻糖能夠很好地保護(hù)機(jī)動球蛋白的穩(wěn)定性。目前有關(guān)腌制工藝條件對草魚肉品質(zhì)的影響研究還不夠深入。結(jié)合感官評定，利用響應(yīng)面法分析優(yōu)化干腌工藝條件的研究尚未見報(bào)道。本文以草魚為原材料，腌漬草魚肉中氯化鈉含量、鹽溶性蛋白含量以及鹽鹵中蛋白質(zhì)含量為考察指標(biāo)，建立產(chǎn)品感官評定與這3項(xiàng)指標(biāo)之間的數(shù)學(xué)模型。利用響應(yīng)面法分析不同腌制條件對產(chǎn)品感官評定結(jié)果的影響，優(yōu)化腌制過程中的關(guān)鍵參數(shù)，為改進(jìn)臘魚干腌工藝提供理論參考。

表1 臘魚感官評定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Standards of sensory evaluation for cured fish

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮活草魚 2008年12月購買于杭州市閘弄口水產(chǎn)品市場，質(zhì)量（2.5±0.5）kg，體長（60±3）cm。清洗新鮮草魚，沿脊椎剖開，去內(nèi)臟、去頭、尾和中間脊椎骨，用清水洗凈表面血污，瀝干表面水分，備用；食鹽購于杭州物美超市；標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白溶液（10mg/mL）酪蛋白預(yù)先用微量凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量，根據(jù)純度稱量配成標(biāo)準(zhǔn)液10.0mg/mL，用0.05mol/L氫氧化鈉溶液配制；雙縮肽試劑取硫酸銅（CuSO4·5H2O，AR）1.5g和酒石酸鉀鈉（KNaC4H2O6·4H2O，AR）6.0g分別用蒸餾水250mL溶解后，一并轉(zhuǎn)入1000mL容量瓶中混合，再加入10%的NaOH溶液300mL，隨加隨搖勻，最后用蒸餾水稀釋到刻度，貯存于塑料瓶中，備用。

UV-2600型紫外可見分光光度計(jì)（使用光徑為10mm的比色皿） 尤尼柯（上海）儀器有限公司；BS-210型電子分析天平 Sartorius Instruments Ltd.，Germany。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.2 蛋白質(zhì)含量的測定 采用雙縮脲法測定[8]。

1.2.3 鹽溶性蛋白含量的測定 參考Benjakul等[9]的方法提取魚肉肌原纖維蛋白，采用雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量。

1.2.4 感官評定 按照響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案腌制草魚肉，腌制后刷去表面可見鹽分和鹵汁于15℃風(fēng)箱中風(fēng)干至含水量40%的臘魚制品，取樣于冷水中浸泡10min，再蒸制15min，冷卻至40℃左右時進(jìn)行感官評定。感官評定標(biāo)準(zhǔn)見表1。采用100分制，從組織狀態(tài)、色澤、氣味、味感、咀嚼度等方面綜合打分。根據(jù)組織形態(tài)權(quán)重0.15，色澤權(quán)重0.15，氣味0.3，味感0.3，咀嚼度0.1進(jìn)行數(shù)據(jù)處理[10-11]。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn) 腌制臘魚成品品質(zhì)主要影響因素有腌制時間、腌制溫度、加鹽量等，為了考察各因素對提取效果的影響，首先進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)，以腌制溫度（2、6、10、14℃）、腌制時間（2、6、10、14d）和加鹽量（2%、6%、10%、14%）作為考察因素，以魚肉鹽溶性蛋白質(zhì)和氯化鈉含量以及鹽鹵中蛋白質(zhì)含量作為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)。

1.2.6 響應(yīng)面法優(yōu)化腌制臘魚的腌制工藝 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定腌制條件為時間6d、溫度10℃、加鹽量10%。依據(jù)設(shè)計(jì)軟件Design Expert（Trial version 7.1.3，Stat-Ease Inc.，minneapolis，MN，USA）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、統(tǒng)計(jì)分析和構(gòu)建模型。采用三因素三水平的BBD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)研究響應(yīng)值以及最佳變量的組合。腌制加鹽量（X1）、腌制溫度（X2）、腌制時間（X3）值為自變量；以產(chǎn)品感官評定為因變量。整個實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在中心點(diǎn)共有17次實(shí)驗(yàn)、5個重復(fù)，實(shí)驗(yàn)隨機(jī)完成。按式（1）方程對自變量進(jìn)行編碼：

式中，xi為自變量的編碼值；Xi為自變量的真實(shí)值為實(shí)驗(yàn)中心點(diǎn)處自變量的真實(shí)值；△Xi為自變量的變化步長。自變量值和自變量水平見表2。按照Design Expert軟件的二次多項(xiàng)式方程進(jìn)行擬合的方程見式（2）：

式中，Y是響應(yīng)值；β0、βj、βjj、βij分別是回歸方程的常數(shù)項(xiàng)、線性系數(shù)、二次相系數(shù)、交互項(xiàng)系數(shù)；Xi和Xj是自變量值。

表2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平Table 2 Factors and levels design of experiment

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 采用Excel和SPSS 11.5.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。所有樣品均作三次平行，測定結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Means±SD）表示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用ANOVA進(jìn)行鄧肯（Dunken）差異分析，以p＜0.05為顯著（*）。

為了給父親出版詩集，水仙芝還專程跑了一趟上海。她跟夏梓桑一起登上東方明珠塔，傍晚漫步在黃浦江畔。從少女時代起，水仙芝就喜歡幻想，直到現(xiàn)在，她還活在文學(xué)的夢境中。

2 結(jié)果與討論

2.1 臘魚肉腌制條件的單因素實(shí)驗(yàn)

以魚肉鹽溶性蛋白質(zhì)和氯化鈉含量以及鹽鹵中蛋白質(zhì)含量為指標(biāo)，分別考察腌制時間、腌制溫度和加鹽量對各指標(biāo)的影響。

2.1.1 腌制溫度對魚肉和鹽鹵成分的影響 取鮮草魚肉，在不同溫度下用加鹽量為10%（W∶W）腌制6d。對魚肉和鹽鹵中的相關(guān)成分進(jìn)行測定，結(jié)果如圖1所示。

圖1 腌制溫度對魚肉和鹽鹵中蛋白質(zhì)總量成分的影響Fig.1 The effect of temperature on the component of fish

由圖1可知，隨著腌制溫度的升高，魚肉中鹽分增加，鹽溶性蛋白含量降低，鹽鹵中蛋白質(zhì)含量升高。在加鹽量10%、腌制時間6d、腌制溫度6℃或10℃的條件下，實(shí)驗(yàn)結(jié)果較接近。從實(shí)驗(yàn)室溫控設(shè)備及考慮實(shí)際生產(chǎn)，將腌制溫度控制在10℃比較可行，因此選擇10℃為適宜的腌制溫度。

2.1.2 腌制時間對魚肉和鹽鹵成分的影響 在10℃、10%鹽度下腌制草魚肉，不同腌制時間對各項(xiàng)指標(biāo)的影響結(jié)果如圖2所示。

圖2 腌制時間對魚肉和鹽鹵成分的影響Fig.2 The effect of time on the component of fish muscle and bittern

由圖2可知，腌制時間與魚肉中氯化鈉含量及鹽鹵中蛋白質(zhì)呈正相關(guān)；而魚肉中鹽溶性蛋白的含量隨腌制時間的延長，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。腌制時間為6d時，魚肉中鹽溶性蛋白含量為2.55g/100g，高于腌制3、9、12d時測得的鹽溶性蛋白含量（分別為2.41%、2.37%和2.03%）。魚肉腌制過程中一個重要的變化即為蛋白質(zhì)的變性，這會導(dǎo)致肌原纖維蛋白的溶解度降低，魚肉中鹽溶性蛋白含量減少，蛋白質(zhì)的持水能力下降，腌魚制品的口感變差[1]。因此鹽溶性蛋白含量在一定程度上反映了魚肉蛋白質(zhì)的變性情況。為使產(chǎn)品含有較高的鹽溶性蛋白和適宜的氯化鈉含量，選用腌制時間6d為宜。

2.1.3 腌制鹽度對魚肉和鹽鹵成分的影響 將不同鹽量添加到草魚肉中，10℃腌制6d，各指標(biāo)的測定結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看出，隨著鹽度的提高，魚中氯化鈉含量明顯提高，魚肉鹽溶性蛋白含量逐漸下降，鹽鹵中蛋白質(zhì)含量顯著性上升。腌制時魚肉蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分析出，造成鹽鹵中蛋白質(zhì)含量上升。為控制營養(yǎng)成分的流失，應(yīng)盡量降低鹽鹵中蛋白質(zhì)含量，同時保持魚肉中高水平鹽溶性蛋白含量和適宜的氯化鈉含量。觀察圖3中各指標(biāo)的變化趨勢，以10%的加鹽量為宜。

圖3 腌制加鹽量對魚肉和鹽鹵成分的影響Fig.3 The effect of concentration of brine on the component of fish muscle and bittern

魚肉肌原纖維蛋白包括肌球蛋白、肌動蛋白、原肌球蛋白、副肌球蛋白、肌鈣蛋白等，它們可以被離子強(qiáng)度0.5以上的中性鹽溶液抽提出來，所以又稱為鹽溶性蛋白。蛋白質(zhì)的功能特性主要由肌原纖維蛋白決定。蛋白質(zhì)變性后肌原纖維蛋白的溶解度降低，鹽溶性蛋白含量減少，從而使魚肉的持水能力下降，魚肉中水分析出，導(dǎo)致大量溶解性蛋白的流失，魚肉口感變得粗糙，食用品質(zhì)下降。

由圖1～圖3可知，魚肉中的鹽溶性蛋白含量隨腌制溫度的上升有所降低，但不明顯；隨腌制時間的延長呈微弱的先升后降趨勢；而鹽度對鹽溶性蛋白含量的影響最明顯，隨腌制加鹽量的提高，魚肉中鹽溶性蛋白含量顯著性降低。各因素對干法腌制和濕法腌制的作用稍有不同，楊文鴿等[4]在優(yōu)化海鰻濕腌工藝中得出的結(jié)論是腌制液體的鹽度對魚肉中鹽溶性蛋白含量影響不大。魚肉氯化鈉含量及鹽鹵中蛋白質(zhì)含量與腌制時間、腌制溫度和腌制加鹽量呈正相關(guān)，這與譚汝成等[3]研究白鰱腌制過程中魚肉與鹽鹵成分的變化結(jié)論類似。為使腌制后的草魚肉含較多的鹽溶性蛋白，并且咸淡適宜，營養(yǎng)損失小，初步得出的較佳的腌制條件為時間6d、溫度10℃、加鹽量10%。

2.2 臘魚腌制工藝的響應(yīng)面分析與優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面（RSM）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果 依據(jù)設(shè)計(jì)軟件Design Expert進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、統(tǒng)計(jì)分析和構(gòu)建模型。采用三因素三水平的BBD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)研究響應(yīng)值以及最佳變量的組合。腌制加鹽量（X1）、腌制溫度（X2）、腌制時間（X3）值為自變量；以產(chǎn)品感官評定為因變量。因變量值（感官評定值）見表3。

2.2.2 感官評定結(jié)果與測定指標(biāo)間數(shù)學(xué)模型的建立

魚肉中鹽溶性蛋白含量、鹽鹵中蛋白質(zhì)含量及魚肉中氯化鈉含量是考察腌制工藝的重要指標(biāo)，對不同腌制條件下的這三項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行測定，并對相應(yīng)產(chǎn)品進(jìn)行感官評定。對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Design-Expert軟件進(jìn)行二次回歸擬合，得到回歸方程：

由回歸方程系數(shù)可知，對感官評定結(jié)果的影響：X3（加鹽量）＞X1（腌制溫度）＞X2（腌制時間）。通過Design-Expert軟件進(jìn)行方差分析，驗(yàn)證回歸模型及各參數(shù)的顯著性，結(jié)果見表4。

表3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表及結(jié)果Table 3 The design and results of Box-Behnken experiments

表4 響應(yīng)面方差分析Table 4 Analysis of variance for response surface

由表4可以看出，模型的p＜0.0001，說明該模型在概率α=0.01水平上能夠擬合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，回歸模型高度顯著。模型中參數(shù)X3、X1X2、X12、X22、X32的p＜0.01，說明腌制加鹽量X3對感官評定結(jié)果的影響高度顯著；而腌制溫度的p＜0.05，影響較顯著。

模型失擬項(xiàng)表示模型預(yù)測值與實(shí)際值不擬合的概率[3]。表4中模型失擬項(xiàng)的p=0.0667（＞0.05），模型失擬項(xiàng)不顯著，說明所選模型適宜。同時由軟件分析得到的模型的相關(guān)系數(shù)R2為94.84%，R2＞90%，說明模型相關(guān)度很好。變異系數(shù)（CV）反映模型的置信度，CV值越低，模型的置信度越高。本實(shí)驗(yàn)的CV值為1.83%，說明模型方程能夠很好的反映真實(shí)的實(shí)驗(yàn)值，可以使用該模型來分析響應(yīng)值的變化。

2.2.3 響應(yīng)面交互作用分析與優(yōu)化 為進(jìn)一步研究相關(guān)變量之間的交互作用以及確定最優(yōu)點(diǎn)，通過Design-Expert軟件繪制響應(yīng)面曲線圖，進(jìn)行可視化分析。圖4～圖6分別顯示3組實(shí)驗(yàn)參數(shù)以感官評定為響應(yīng)值的趨勢圖。響應(yīng)曲面圖可以直觀地反映兩變量交互作用的顯著程度，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形與之相反[12]。

圖4 Y=F（X1：腌制溫度，X2：腌制時間）對感官評定值影響的響應(yīng)曲面圖Fig.4 Response surface plot of the effects of X1and X2on the sensory evaluation value

從圖4可以看出，時間和溫度的交互作用對感官評定結(jié)果影響較大。隨著腌制時間的增長及腌制溫度的提高，感官評定的分值呈先升后降趨勢，其主要原因在于魚肉中氯化鈉含量逐漸升高，達(dá)到一定量時咸淡適宜。隨著腌制時間的增長及腌制溫度的提高，魚肉中的鹽溶性蛋白含量降低，組織致密性下降。因此，只有在適宜的鹽度和溫度下腌制魚肉，感官評定的結(jié)果才會較理想。同樣，從圖5、圖6可以看出，只有鹽度與時間、溫度與鹽度的比例適合，感官評定值才能達(dá)到最大值。

圖5 Y=F（X1：腌制溫度，X3：腌制鹽度）對感官評定值影響的響應(yīng)曲面圖Fig.5 Response surface plot of the effects of X1and X3on the sensory evaluation value

圖6 Y=F（X2：腌制時間，X3：腌制鹽度）對感官評定值影響的響應(yīng)曲面圖Fig.6 Response surface plot of the effects of X2and X3on the sensory evaluation value

由圖4～圖6中響應(yīng)曲面圖可以看出，響應(yīng)值存在最大值。通過軟件分析、計(jì)算，當(dāng)感官評定的最大預(yù)測值為93.49時，腌制溫度為9.29℃，腌制時間6.02d，加鹽量11.70%?？紤]實(shí)際操作性，將工藝條件優(yōu)化為腌制溫度9.3℃，腌制時間6d，加鹽量11.70%。為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測的準(zhǔn)確性，按上述優(yōu)化的工藝參數(shù)進(jìn)行腌制，實(shí)際測得草魚肉中鹽溶性蛋白含量2.56%、鹽鹵中蛋白含量0.7%、臘魚中氯化鈉含量4.07g/100g。與其他條件下腌制的產(chǎn)品相比，優(yōu)化條件下腌制的魚肉中鹽溶性蛋白含量較高，鹽鹵中蛋白質(zhì)含量較少，所得臘魚的感官評分值為93.50分，與理論預(yù)測值（93.49分）基本相符。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過響應(yīng)面建立數(shù)學(xué)模型，優(yōu)化得到的草魚干腌工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠。在此條件下制得的臘魚不但具有豐富的營養(yǎng)價值，而且改善了口感。

3 結(jié)論

臘魚氯化鈉含量及鹽鹵中蛋白質(zhì)含量與腌制時間、溫度和加鹽量呈正相關(guān)。腌制時間、溫度對魚肉鹽溶蛋白含量有一定影響。通過響應(yīng)面交互作用分析，優(yōu)化的干腌工藝條件為腌制溫度為9.3℃，腌制時間6d，加鹽量11.70%。在此條件下腌制、烘干后的臘魚制品的感官評分值為93.50分，與理論值（93.49分）基本相符。模型方程能夠很好地反映真實(shí)的實(shí)驗(yàn)值，因此，本論文結(jié)果可為工廠大規(guī)模生產(chǎn)腌制臘魚提供理論指導(dǎo)。

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