源自合作藏區(qū)優(yōu)良乳酸菌的酸奶發(fā)酵劑發(fā)酵條件優(yōu)化

秦 虹，梁 琪，張衛(wèi)兵，張 炎，米 蘭

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.甘肅省功能乳品工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730070）

酸奶因其豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、良好的保健功能以及特殊的口感，越來(lái)越受到廣大消費(fèi)者的青睞，但其品質(zhì)受發(fā)酵劑、發(fā)酵條件等因素的影響[1]。若發(fā)酵劑產(chǎn)酸過(guò)快，會(huì)使酸奶質(zhì)地粗糙、黏度降低并析出大量的乳清，且在貯藏過(guò)程中活菌數(shù)下降、后酸化增強(qiáng)，從而影響酸奶的貨架期；若發(fā)酵劑產(chǎn)酸過(guò)慢，會(huì)使酸奶的發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，產(chǎn)酸不足，導(dǎo)致酸奶的品質(zhì)變差[2-3]。而發(fā)酵條件決定了發(fā)酵劑的產(chǎn)酸速率、凝乳時(shí)間、酸奶的組織狀態(tài)及風(fēng)味的形成等[1，4]。商業(yè)上常用的發(fā)酵劑一般由嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌組合而成，在酸奶發(fā)酵過(guò)程中它們的相互關(guān)系會(huì)表現(xiàn)為拮抗作用和協(xié)同作用[5]。對(duì)菌株進(jìn)行組合發(fā)酵主要是利用菌株間的協(xié)同作用，使其代謝產(chǎn)物相互利用，促進(jìn)生長(zhǎng)，提高產(chǎn)酸速率，增強(qiáng)酸化能力，減弱后酸化能力，促進(jìn)風(fēng)味物質(zhì)和更多胞外多糖的產(chǎn)生等，使各菌株的優(yōu)勢(shì)在產(chǎn)品中一起表現(xiàn)出來(lái)[6]。發(fā)酵條件會(huì)直接影響發(fā)酵成品酸奶的品質(zhì)，這些發(fā)酵條件主要有發(fā)酵溫度、發(fā)酵劑的接種量、球桿菌的復(fù)配比例和蔗糖的添加量[7]。發(fā)酵溫度、發(fā)酵劑的接種量和復(fù)配比例對(duì)菌體的酸化能力、后酸化能力及胞外多糖的產(chǎn)生等有影響，從而對(duì)產(chǎn)品的品質(zhì)產(chǎn)生影響；蔗糖添加量會(huì)影響產(chǎn)品的風(fēng)味[8]。因此，用從合作藏區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛乳中分離篩選并經(jīng)鑒定的嗜熱鏈球菌Q4和保加利亞乳桿菌G4混菌發(fā)酵酸奶，對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，可以為菌株的工業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)，并為自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的酸奶發(fā)酵劑研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

洪澤縣境內(nèi)的縣鄉(xiāng)河道已進(jìn)行了多輪治理，但以往河道整治主要是清淤。由于上游泥土的帶入、水體對(duì)河床的淘刷，局部河堤、河坡墾種、傾倒垃圾現(xiàn)象的存在，加速了河道的淤積速度，先期疏浚河道又有回淤現(xiàn)象，因此，仍不同程度存在引排不暢、水體交換緩慢、灌排效益下降等問(wèn)題。

也許是動(dòng)作太快，等這一切結(jié)束時(shí)，周教授幾個(gè)還張著大嘴愣怔著。只有可蔓不驚不慌，正像一個(gè)長(zhǎng)官似地在那教訓(xùn)一個(gè)長(zhǎng)著娃娃臉的八路軍?？陕闹尥薇拿弊诱f(shuō)，是不是新兵蛋子嘛，怎么連駁殼槍都不會(huì)打嘛，要平端著打知道不？

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

嗜熱鏈球菌Q4（Streptococcus thermophilus）、保加利亞乳桿菌G4（Lactobacillus bulgaricus） 均由甘肅省功能乳品工程實(shí)驗(yàn)室保藏，分離自合作藏區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳中；脫脂乳 黑龍江完達(dá)山乳業(yè)。

SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；YX-280手提式壓力蒸汽滅菌鍋 上海三申醫(yī)療器械有限公司；HG303-4電熱恒溫培養(yǎng)箱 南京實(shí)驗(yàn)儀器廠；PB-203電子天平 Mettler-Toledo公司；pHS-25數(shù)顯pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器廠；LVDV-1旋轉(zhuǎn)式數(shù)顯粘度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

表1 發(fā)酵乳感官評(píng)價(jià)表Tabel 1 The score table for sensory evaluation of fermented milk

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 指標(biāo)的測(cè)定

1.2.1.4 活菌數(shù)的測(cè)定 將凝固后的發(fā)酵乳置于4℃冷藏24h后，將樣品放置至室溫，吸取1mL進(jìn)行梯度稀釋，選取合適的梯度稀釋液涂布于MRS的固體培養(yǎng)基上，在37℃下培養(yǎng)2d，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)[10]。

1.2.2.4 最佳菌種復(fù)配比例的確定 活化好的菌株按1∶2、2∶2、3∶2、4∶2、5∶2的（球∶桿）比例，3%的接種量接種于含6%（g/mL）蔗糖的滅菌脫脂乳中，置于37℃培養(yǎng)，記錄凝乳時(shí)間，測(cè)定酸度、黏度和活菌數(shù)并進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

寶寶的性格是通過(guò)什么渠道形成的呢？性格是一個(gè)人對(duì)客觀現(xiàn)實(shí)的穩(wěn)固態(tài)度和慣常的行為方式，是人與人、人與環(huán)境相互作用的結(jié)果。雖然先天氣質(zhì)對(duì)人的性格有一定的影響，但是性格主要是在后天形成的。

1.2.1.3 黏度的測(cè)定 將凝固后的發(fā)酵乳置于4℃冷藏24h后，用LVDV-1型黏度計(jì)在4℃測(cè)定其黏度，單位為Pa·s[9]。

通過(guò)以下例句，學(xué)生可歸納出when，where和why以及“介詞+which”如何實(shí)現(xiàn)與先行詞的照應(yīng)。

1.2.1.1 凝乳時(shí)間 將活化好的菌株按一定的比例接種到12%滅菌脫脂乳中，在適當(dāng)?shù)臏囟认掳l(fā)酵至凝乳，記錄凝乳時(shí)間。

1.2.1.5 感官評(píng)價(jià) 將凝固后的發(fā)酵乳置于4℃冷藏24h后，由7個(gè)感官評(píng)價(jià)專家對(duì)樣品的色澤和滋味、組織狀態(tài)等指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)[11-13]。

1.2.2.1 最佳發(fā)酵溫度的確定 活化好的菌株按1∶1（球∶桿）的比例，3%接種量接種于含6%（g/mL）蔗糖的滅菌脫脂乳中，置于31、34、37、40、43℃發(fā)酵，記錄凝乳時(shí)間，測(cè)定酸度、黏度和活菌數(shù)并進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

風(fēng)險(xiǎn)匹配制度是指商業(yè)銀行只能向客戶銷售風(fēng)險(xiǎn)評(píng)級(jí)等于或低于其風(fēng)險(xiǎn)承受能力評(píng)級(jí)的理財(cái)產(chǎn)品。2011年頒布的《商業(yè)銀行理財(cái)產(chǎn)品銷售管理辦法》（以下簡(jiǎn)稱為《辦法》）明確規(guī)定商業(yè)銀行銷售理財(cái)產(chǎn)品應(yīng)當(dāng)遵循風(fēng)險(xiǎn)匹配原則，禁止誤導(dǎo)客戶購(gòu)買與其風(fēng)險(xiǎn)承受能力不相符合的理財(cái)產(chǎn)品。然而，因?yàn)槿狈︼L(fēng)險(xiǎn)匹配制度的具體實(shí)施細(xì)則，風(fēng)險(xiǎn)測(cè)評(píng)的可操作性差，容易造成商業(yè)銀行對(duì)理財(cái)產(chǎn)品的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)級(jí)和對(duì)投資者的風(fēng)險(xiǎn)承受能力的評(píng)級(jí)流于形式，誤導(dǎo)投資者購(gòu)買高于其風(fēng)險(xiǎn)承受能力的理財(cái)產(chǎn)品。

2.1.4 最佳復(fù)配比例的確定 在酸奶生產(chǎn)中，通常將球、桿菌復(fù)配發(fā)酵酸奶，桿菌的對(duì)產(chǎn)酸起主導(dǎo)作用，而球菌通常具有較強(qiáng)的凝乳作用，但是在發(fā)酵劑中桿菌的比例較大時(shí)，發(fā)酵劑的后酸化能力強(qiáng)，對(duì)產(chǎn)品的品質(zhì)產(chǎn)生影響[1]。

1.2.2.2 最佳蔗糖添加量的確定 活化好的菌株按1∶1，3%接種量接種于含 4%、5%、6%、7%、8%（g/mL）蔗糖的滅菌脫脂乳中，置37℃培養(yǎng)，記錄凝乳時(shí)間，測(cè)定酸度、黏度和活菌數(shù)并進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

1.2.1.2 滴定酸度的測(cè)定 根據(jù)GB/T 5413.34-2010方法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 最佳發(fā)酵條件的優(yōu)化 基于單因素實(shí)驗(yàn)，選取因素與水平，以感官評(píng)價(jià)評(píng)分值為響應(yīng)值，通過(guò)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化[14-16]。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 2 Experimental level and code of variables chosen of Box-Behnken

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 17.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

教師是太陽(yáng)底下最光輝的職業(yè)，也是最平凡的職業(yè)?！俺砸睬宓?，穿也素雅，心懷淡泊，起始于辛勞，收結(jié)于平淡”，這正是教師的人生寫照。學(xué)生的每一次成長(zhǎng)和進(jìn)步都會(huì)給教師帶來(lái)巨大的欣慰，驅(qū)散生活中的陰霾，激勵(lì)著我們不斷啟程、向前。每位教師都應(yīng)該努力追求成為一名真正的“人師”，做好學(xué)生的引路人，為實(shí)現(xiàn)偉大而燦爛的中國(guó)夢(mèng)添磚加瓦。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 最佳發(fā)酵溫度的確定 從表3可知，隨著發(fā)酵溫度的增大，酸奶的凝乳時(shí)間縮短，說(shuō)明溫度越高，產(chǎn)酸速率越大，達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)的時(shí)間越短[17]；滴定酸度逐漸增大；黏度呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，其他溫度下發(fā)酵的酸奶的黏度顯著的高于43℃（p＜0.05），與John A[17]的研究報(bào)道相一致?；罹鷶?shù)呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢(shì)，是因?yàn)檩^低的溫度有利于菌體生長(zhǎng)[18]。在不同發(fā)酵溫度條件下，酸奶感官評(píng)價(jià)評(píng)分差異顯著（p＜0.05），40℃發(fā)酵時(shí)，酸奶的感官評(píng)價(jià)評(píng)分明顯高于其他實(shí)驗(yàn)組，呈微黃色，組織狀態(tài)細(xì)膩光滑，且無(wú)乳清析出。因此，40℃為最佳發(fā)酵溫度。

2.1.2 最佳蔗糖添加量的確定 不同的蔗糖添加量可以調(diào)節(jié)酸奶最終的酸甜比，使酸奶的風(fēng)味有所改善。從表4可知，在不同的蔗糖添加量下，凝乳時(shí)間、滴定酸度、黏度差異不顯著（p＞0.05），因此，不同的蔗糖添加量對(duì)凝乳時(shí)間、滴定酸度、黏度沒有影響，這與王攀[8]的研究結(jié)果一致?；罹鷶?shù)呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，5%蔗糖添加量時(shí)，活菌數(shù)最高，為9.66lg CFU/mL。5%蔗糖添加量時(shí)酸奶中的活菌數(shù)與8%蔗糖添加量時(shí)差異顯著（p＜0.05），其他實(shí)驗(yàn)組之間差異都不顯著（p＞0.05）。不同的蔗糖添加量對(duì)酸奶的感官評(píng)價(jià)評(píng)分影響顯著，當(dāng)加糖量為5%時(shí)，感官評(píng)價(jià)評(píng)分顯著的高于其他實(shí)驗(yàn)組（p＜0.05），酸甜比例適中，風(fēng)味最佳；當(dāng)蔗糖添加量為4%，酸奶酸味較重；當(dāng)蔗糖添加量為6%、7%、8%時(shí)，酸奶甜味較重。因此，5%為最佳蔗糖添加量。

表3 發(fā)酵溫度的確定Table 3 Determination of the fermentation temperature

表4 蔗糖添加量的確定Table 4 Determination of the addition of suger

表5 接種量的確定Table 5 Determination of the inoculation rate

表6 菌種復(fù)配比例的優(yōu)化結(jié)果Table 6 Determination of the mixing ratio for strains

2.1.3 最佳接種量的確定 發(fā)酵劑接種量過(guò)低，產(chǎn)酸速率較慢，使酸奶的凝乳時(shí)間延長(zhǎng)，影響產(chǎn)品的最終品質(zhì)；接種量過(guò)高，產(chǎn)酸速率加快，使酸奶的凝乳時(shí)間縮短，但酸味較重、組織狀態(tài)較差且有大量的乳清析出[19]。從表5可知，隨著接種量的增大凝乳時(shí)間縮短，滴定酸度增大，活菌數(shù)增大，且他們差異都顯著（p＜0.05）。黏度呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，3%接種量時(shí)，黏度達(dá)最大，為7.96Pa·s，與4%接種量差異不顯著（p＞0.05），與其他實(shí)驗(yàn)組差異顯著（p＜0.05）。發(fā)酵劑接種量對(duì)酸奶的感官評(píng)價(jià)評(píng)分影響顯著（p＜0.05），當(dāng)發(fā)酵劑接種量3%時(shí)，酸奶組織狀態(tài)細(xì)膩，表面光滑，無(wú)乳清析出，且感官評(píng)價(jià)評(píng)分顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組（p＜0.05）。因此，3%為最佳發(fā)酵劑接種量。

1.2.2.3 最佳接種量的確定 活化好的菌株按1∶1，1%、2%、3%、4%、5%的接種量接種于含6%（g/mL）蔗糖的滅菌脫脂乳中，置于37℃培養(yǎng)，記錄凝乳時(shí)間，測(cè)定酸度、黏度和活菌數(shù)并進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

美團(tuán)點(diǎn)評(píng) CEO王興曾說(shuō)過(guò)，“按每人一頓飯10元計(jì)算，一年在餐飲上的消費(fèi)至少1萬(wàn)元。作為一門入口的生意，14億人帶來(lái)的就是14萬(wàn)億元的市場(chǎng)。”

從表6可知，在不同復(fù)配比例的條件下，凝乳時(shí)間和活菌數(shù)差異不顯著（p＞0.05）。滴定酸度差異顯著（p＜0.05），隨桿菌比例的增大而增大。這一結(jié)果與Cais-sokolinska D[20]的報(bào)道是一致的。復(fù)配比例對(duì)酸奶的黏度有一定的影響，隨著嗜熱鏈球菌比例的增大而增大，混合菌中嗜熱鏈球菌體積分?jǐn)?shù)較高時(shí)更利于黏性物質(zhì)的產(chǎn)生[21]。當(dāng)復(fù)配比例為1∶1時(shí)，產(chǎn)品組織狀態(tài)良好，口感光滑細(xì)膩，酸甜比例適中，風(fēng)味最佳，且感官評(píng)價(jià)評(píng)分顯著的高于其他實(shí)驗(yàn)組（p＜0.05）。因此，1∶1為菌種的最佳復(fù)配比例。

由表6模型回歸結(jié)果可知，在95%的置信區(qū)間下，X 2，X 3，X 4，X 5，X 6的 T統(tǒng)計(jì)量所對(duì)應(yīng)的 P值均小于0.01，即國(guó)內(nèi)市場(chǎng)規(guī)模，年平均匯率，嬰幼兒配方乳粉的進(jìn)口平均價(jià)格，國(guó)產(chǎn)產(chǎn)品和進(jìn)口產(chǎn)品的抽檢合格率都是影響嬰幼兒配方乳粉進(jìn)口量的顯著因素。根據(jù)回歸結(jié)果可以得出以下方程：

2.2 最佳發(fā)酵條件優(yōu)化

基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表7。

表7 Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及及響應(yīng)值結(jié)果Table 7 Test design and results of Box-Benhnken

利用Design Expert 8.0擬合實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到回歸方程：

通過(guò)分析回歸系數(shù)可知各因素影響感官評(píng)價(jià)評(píng)分的主次順序?yàn)椋喊l(fā)酵溫度＞蔗糖添加量＞接種量＞復(fù)配比例。對(duì)該回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表8。從表8可知，發(fā)酵溫度、蔗糖添加量對(duì)響應(yīng)值的影響極顯著（p＜0.01），接種量對(duì)響應(yīng)值影響顯著（p＜0.05），表明這3個(gè)因素對(duì)感官評(píng)價(jià)評(píng)分的線性效應(yīng)顯著；所有因素的二次項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值的曲面效應(yīng)極顯著（p＜0.01）；蔗糖添加量和接種量的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響極顯著（p＜0.01），表明各影響因素對(duì)感官評(píng)價(jià)的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。該模型達(dá)到極顯著水平（p＜0.001），方程的失擬項(xiàng)不顯著（p=0.2920），模型選擇合適。其校正決定系數(shù)（R2Adj）為0.9566，說(shuō)明此模型對(duì)實(shí)驗(yàn)擬合度較高。

表8 Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)方差分析Table 8 Analysis of variance for Box-Benhnken

根據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)面圖（見圖1～圖6），考察所擬合的響應(yīng)曲面的形狀，分析發(fā)酵溫度、蔗糖添加量、接種量、復(fù)配比例對(duì)感官評(píng)價(jià)評(píng)分的影響。從響應(yīng)面的最高點(diǎn)可以看出，在所選的范圍內(nèi)存在極值，即為響應(yīng)面的最高點(diǎn)。

圖1 發(fā)酵溫度和蔗糖添加量對(duì)感官評(píng)價(jià)評(píng)分影響的響應(yīng)面圖Fig.1 Effect of the fermentation temperature and amount of suger on sensory evaluation score

從圖1～圖6可以看出，發(fā)酵溫度和蔗糖添加量是影響感官評(píng)價(jià)的重要因素，接種量次之，復(fù)配比例影響不大。從圖4可以看出，當(dāng)發(fā)酵溫度和復(fù)配比例為中心水平時(shí)，蔗糖添加量和接種量的交互作用對(duì)感官評(píng)價(jià)的影響極顯著。其他因素的交互作用對(duì)響應(yīng)值影響不大。

圖2 發(fā)酵溫度和接種量對(duì)感官評(píng)價(jià)評(píng)分影響的響應(yīng)面圖Fig.2 Effect of the fermentation temperature and inoculation rate on sensory evaluation score

圖3 發(fā)酵溫度和復(fù)配比例對(duì)感官評(píng)價(jià)評(píng)分影響的響應(yīng)面圖Fig.3 Effect of the fermentation temperature and mixing ratio on sensory evaluation score

圖4 蔗糖添加量和接種量對(duì)感官評(píng)價(jià)評(píng)分影響的響應(yīng)面圖Fig.4 Effect of the amount of suger and inoculation rate on sensory evaluation score

圖5 蔗糖添加量和復(fù)配比例對(duì)感官評(píng)價(jià)評(píng)分值影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Effect of the amount of suger and mixing ratio on sensory evaluation score

圖6 接種量和復(fù)配比例對(duì)感官評(píng)價(jià)評(píng)分影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Effect of the inoculation rate and mixing ratio on e sensory evaluation score

對(duì)回歸方程求導(dǎo)，得到極大值為88.52，對(duì)應(yīng)的發(fā)酵溫度為41.18℃，蔗糖添加量為5.17%，接種量為2.90%，復(fù)配比例為（球∶桿）為0.96∶1，為方便實(shí)驗(yàn)，將發(fā)酵溫度定為41.2℃，蔗糖添加量定為5.2%，接種量定為3%，復(fù)配比例定為1∶1。為檢驗(yàn)響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性，采用上述發(fā)酵條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，感官評(píng)價(jià)評(píng)分為89.67±1.53。與理論預(yù)測(cè)值相比，其相對(duì)誤差約為1.28%。說(shuō)明該數(shù)學(xué)模型對(duì)酸奶發(fā)酵劑的發(fā)酵條件預(yù)測(cè)較為準(zhǔn)確。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)、Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以及響應(yīng)面分析法，建立響應(yīng)值與各因素之間的數(shù)學(xué)模型，此模型對(duì)實(shí)驗(yàn)擬合很好。各因素影響感官評(píng)價(jià)評(píng)分的順序?yàn)榘l(fā)酵溫度＞蔗糖添加量＞接種量＞復(fù)配比例。根據(jù)回歸模型，得出了酸奶發(fā)酵劑的最優(yōu)發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度41.2℃，蔗糖添加量為5.2%，接種量3%，復(fù)配比例1∶1。在此條件下發(fā)酵酸奶，其感官評(píng)價(jià)評(píng)分預(yù)測(cè)值為88.52，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的酸奶感官評(píng)價(jià)評(píng)分為89.67±1.53。本實(shí)驗(yàn)為分離篩選出的菌株的實(shí)際應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，并為研發(fā)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的酸奶提供了理論依據(jù)。

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