藍莓花青素的純化及鎮(zhèn)痛、抗炎藥效學研究

王 靜，馬養(yǎng)民，逯文靜

(陜西科技大學化學與化工學院，教育部輕化工助劑化學與技術重點實驗室，陜西西安710021)

藍莓，學名越橘，杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vaccinium Linn.)植物，果實營養(yǎng)豐富，含有維生素、蛋白質、花青素及黃酮等多種活性成分，其中花青素含量位居所有水果、蔬菜之首。自然狀態(tài)下，植物體內的花青素常與多種單糖結合形成糖苷，故又稱花青苷?；ㄇ嗨鼐哂锌寡趸?、抗腫瘤、保護肝臟、增強視力等多種生理功能。研究表明，花青素安全、低毒，口服45min后可進入人體各個組織器官，具有良好的生物利用度［1-3］。藍莓果大約含有5種以花青素為母本的花青苷［4］，成分復雜，對花青素的純化造成了一定困難;大孔樹脂吸附法是近年來花青素純化常用的方法之一。目前，藍莓花青素的生理活性研究多集中在抗氧化能力的評估、視力保護及抗腫瘤等方面，然而鎮(zhèn)痛和抗炎作用的研究卻鮮有報道。本文比較了2種大孔吸附樹脂對花青素的純化效果，并采用小鼠受熱致痛法和二甲苯致小鼠耳廓腫脹法對純化后的花青素進行鎮(zhèn)痛抗炎實驗，進一步完善花青素生物活性研究，對藍莓食品的開發(fā)和深加工以及花青素的衛(wèi)生保健應用提供發(fā)展方向。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藍莓 2010年采自陜西省寧陜縣;D101樹脂 山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司;Amberlite XAD-7樹脂 北京慧德易科技有限責任公司;95%乙醇、甲醇、鹽酸、二甲苯、乙醚均為市售分析純;三氟乙酸(TFA)Sigma公司;昆明種健康小白鼠(雄性)體重18～25g，清潔級，第四軍醫(yī)大學提供，合格證號:SCXK(軍)2007-007。

紫外-可見分光光度計DR5000 美國Hach公司;數(shù)控超聲波清洗器KQ2200DE 昆山市超聲儀器有限公司;恒溫水浴鍋R201L 上海申生科技有限公司;干燥箱101-1 上海市實驗儀器總廠;離心機800B上海安亭科學儀器廠;酸度計PB-10 Sartorius公司;電子分析天平BS2202S Sartorius公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 藍莓花青素的純化 首先進行花青素提取，將藍莓果打碎，酸化的60%乙醇溶液于30℃水浴中超聲提取40min，提取液過濾，旋轉薄膜蒸發(fā)儀減壓濃縮。將浸膏分成兩份，一份用D101樹脂純化，另一份用Amberlite XAD-7樹脂純化。

D101樹脂純化時，浸膏與樹脂體積1∶5，濕法裝柱，用乙醇洗脫2～3個保留體積(BV)至洗脫液無色透明，再用蒸餾水洗至無醇味，上樣。樣品反復吸附3次，每次6～8h，吸附完全后先用蒸餾水淋洗，除去雜質，檢查流出液至Molish反應為陰性。再分別用20%、40%、60%、95%乙醇梯度洗脫，收集流出液，減壓濃縮，冷凍干燥，測量其中總花青素含量。(Molish反應:用于檢測糖的存在。取試樣于試管中，加α-萘酚試劑數(shù)滴，搖勻后沿試管壁滴加濃硫酸或濃鹽酸，看是否有紫紅色環(huán)。)

浸膏與Amberlite XAD-7樹脂體積1∶3，濕法裝柱，先用95%乙醇洗脫2～3個BV，再用蒸餾水洗至無醇味，上樣，充分吸附后開始洗脫。先用含0.01%HCl的蒸餾水淋洗，至水溶液澄清為止。再用含0.1%TFA的甲醇溶液洗脫，收集流出液，減壓濃縮，冷凍干燥后測量其中總花青素含量。

選取D101樹脂純化后含量為35%的藍莓花青素進行鎮(zhèn)痛及抗炎藥理活性研究。

1.2.2 總花青素的含量測定 pH示差法［5］測定總花青素含量。純化后花青素分別用pH1.0的0.025mol/L氯化鉀緩沖溶液和pH4.5的0.4mol/L乙酸鈉緩沖溶液溶解并稀釋，紫外-可見分光光度計分別測定其在525nm和700nm的吸光值，用式(1)計算吸光值A:

總花青素含量按下式計算:

其中，A:吸光值，由式(1)計算得到;M:矢車菊色素-3-O-葡萄糖苷的相對分子質量(449.2g/mol);DF:稀釋因子;ε:矢車菊色素-3-O-葡萄糖苷的消光系數(shù)(26900L·cm-1·mol-1);l:比色皿寬度(1cm)。

由花青素的質量可以確定花青素的質量百分含量。

1.2.3 小鼠尾部受熱甩尾法鎮(zhèn)痛實驗 將小鼠尾部約1/3浸入(50±0.5)℃的恒溫水浴中，記錄小鼠自尾部被放入水中起至出現(xiàn)甩尾的時間(s)，作為小鼠的正常痛閾，剔除正常痛閾小于5s或大于30s的小鼠。選擇合格的雄性昆明小鼠48只，隨機分成6組，每組8只。以皮下注射方式給藥，空白組注射生理鹽水，其余5組分別注射不同濃度的花青素溶液(給藥量分別為 1、3、10、30、100mg/kg)，編號為花青素A、B、C、D、E。每組小鼠給藥前重復測定2次痛閾，取平均值作為該鼠的基礎痛閾。給藥后10、20、30、40、50、60min測量小鼠的痛閾，痛閾值超過60s者按60s計算，記錄結果，按下式計算藥品的痛閾提高率，利用t檢驗比較組間差異。

其中，P:痛閾提高率(%);T:給藥后小鼠痛閾(s);T0:給藥前小鼠基礎痛閾(s)。

1.2.4 二甲苯致小鼠耳廓腫脹法抗炎實驗 采用小鼠耳廓腫脹法研究花青素對二甲苯引起的小鼠耳廓腫脹的抗炎作用。取昆明小鼠70只，隨機分成7組(a～g組)，每組10只。a組為空白組(生理鹽水)、b～g組分別為花青素 1、3、10、30、50、100mg/kg 劑量組。以上7組分別以皮下注射給予生理鹽水或相應劑量的花青素0.01mL/g，每日1次，連續(xù)6日。末次注射后1h，將40μL致炎劑二甲苯均勻涂于各個小鼠右耳廓致炎，左耳對照。致炎后1h斷椎處死，沿耳廓基線剪下雙耳，用直徑9mm的打孔器分別在左右兩耳的同一部位打下圓耳片，于分析天平稱重，以左右耳片的重量差作為腫脹度(mg)，計算每組右耳廓腫脹度，并通過式4計算其腫脹抑制率，比較組間差異。

1.2.5 統(tǒng)計學分析 所有數(shù)據(jù)采用“均數(shù)±標準差”表示，用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，組間比較進行單因素方差ANOVA檢驗，重復測量數(shù)據(jù)采用重復測量方差分析，多重比較采用LSD法。

2 結果與討論

2.1 藍莓花青素的純化

從表1看出，D101樹脂的純化效果與洗脫梯度有關，經60%乙醇洗脫，總花青素含量最高，達到35%;而Amberlite XAD-7樹脂純化后，花青素含量接近50%，效果較好。

表1 純化后總花青素含量Table 1 The total content anthocyanins after purification

2.2 藍莓花青素對小鼠尾部受熱致痛反應的影響

花青素各劑量組與空白組比較，均有較顯著性差異。給藥后40min鎮(zhèn)痛效果最為明顯(p＜0.01)，實驗得到10mg/kg劑量的花青素的鎮(zhèn)痛效果最好。

由表3看出，小鼠痛閾提高率不僅與花青素濃度有關，也與花青素體內代謝時間相關。

由表3看出，5個實驗劑量的花青素均具有較好的鎮(zhèn)痛效果，且痛閾提高率隨花青素濃度的增加而呈現(xiàn)出先提高后降低的趨勢。其中花青素劑量為10mg/kg，給藥40min后痛閾提高率最大，鎮(zhèn)痛效果最好;40min后，鎮(zhèn)痛效果逐漸減弱，但是60min時仍具有一定鎮(zhèn)痛效果。

2.3 藍莓花青素對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響

不同劑量花青素給藥組對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹均有一定的抑制作用，與空白組相比，均具有顯著性差異，但是花青素各劑量組之間并無顯著性差異。

表2 花青素對小鼠尾部受熱致痛反應的影響(±s，n=8)Table 2 The effects of heat test on mice after injecting anthocyanins(±s，n=8)

表2 花青素對小鼠尾部受熱致痛反應的影響(±s，n=8)Table 2 The effects of heat test on mice after injecting anthocyanins(±s，n=8)

注:與空白組比較*p＜0.05，＊＊p＜0.01;表4同。

給藥后痛閾(s)組別 劑量(mg·kg-1)±0.4 6.0±0.2花青素A組 1 6.5±0.1 7.2±0.7* 8.0±0.7* 9.0±0.8＊＊ 9.9±1.0＊＊ 7.9±0.6* 7.5±0.5*花青素B組 3 5.8±0.4 6.4±0.4* 7.1±0.5＊＊ 7.8±0.7＊＊ 9.0±0.6＊＊ 7.3±0.5* 6.9±0.7*花青素C組 10 4.0±0.2 6.0±0.5* 8.8±0.2＊＊ 10.5±0.9＊＊11.0±1.2＊＊ 7.3±0.6＊＊ 7.0±0.8*花青素D組 30 4.5±0.7 6.3±0.7* 7.5±0.5* 8.3±0.6* 9.9±0.6＊＊ 6.9±0.5* 6.5±0.4*花青素E組 100 4.8±0.3 6.5±0.4＊＊ 7.1±0.7＊＊ 8.0±0.7* 9.1±0.7＊＊ 7.5±0.6＊＊ 6.2±0.2 10min 20min 30min 40min 50min 60min空白組 - 5.9±0.2 6.0±0.6 6.1±0.8 6.2±0.5 6.0±0.3 6.0基礎痛閾(s)*

表3 花青素對小鼠尾部受熱致痛反應的痛閾提高率Table 3 The improvement of pain threshold on mice after injecting anthocyanins

表4 花青素對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響(±s，n=10)Table 4 The protection of anthocyanins on xylene-induced ear edema in mice(±s，n=10)

表4 花青素對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響(±s，n=10)Table 4 The protection of anthocyanins on xylene-induced ear edema in mice(±s，n=10)

組別 劑量(mg·kg-1)腫脹度(mg)腫脹抑制(%)空白對照組 a組- 7.2±3.1 -花青素樣品組68.1 b組 1 4.4 ±1.9＊＊ 38.9 c組 3 3.5 ±2.0＊＊ 51.4 d組 10 2.9 ±1.3＊＊ 59.7 e組 30 2.0 ±1.1＊＊ 72.2 f組 50 2.2 ±1.4＊＊ 69.4 g組 100 2.3 ± 1.7＊＊

實驗結果表明，花青素能夠提高小鼠的痛閾值，抑制由二甲苯所致的小鼠耳廓腫脹，可能與花青素屬于小分子化合物，易吸收，能穿越血腦屏障，抑制炎癥細胞因子的產生有關［6］。

3 結論

3.1 利用兩種大孔樹脂對藍莓果中提取得到的花青素粗品進行純化，純化后樣品含量均可達到國際入藥要求(＞24%)［7］。經 Amberlite XAD-7 樹脂純化得到的花青素樣品含量接近50%，D101樹脂純化后也可達到35%。雖然Amberlite XAD-7樹脂純化效果較好，但價格昂貴;然而相同浸膏時D101樹脂的用量又較大，所以在工業(yè)生產中，應根據(jù)實際生產情況采取經濟、高效的純化路線。

3.2 首次利用從藍莓果中提取并純化的花青素進行鎮(zhèn)痛及抗炎作用研究。具體實驗采用小鼠受熱致痛法和小鼠二甲苯致耳廓發(fā)炎法，結果表明藍莓花青素可明顯提高小鼠的痛閾值并抑制耳廓腫脹，且效果良好。本研究不僅證實了藍莓花青素的鎮(zhèn)痛、抗炎生理活性，豐富了藍莓作為天然植物的藥用保健價值，為藍莓食品的開發(fā)和深加工提供發(fā)展思路，更為花青素資源的進一步研究、利用提供了理論基礎。

［1］陳介甫，李亞東，徐哲.藍莓的主要化學成分及生物活性［J］.藥學學報，2010，45(4):422-429.

［2］胡雅馨，李京，惠伯棣.藍莓果實中主要營養(yǎng)及花青素成分的研究［J］.食品科學，2006，27(10):600-603.

［3］Chen PN，Chu SC，Chou HL.Mulberry anthocyanins，cyanidin-3-rutinoside and cyanidin-3-glucoside，exhibited an inhibitory effect on the migration and invasion of a human lung cancer cell line［J］.Cancer Letter，2006，235(2):248-259.

［4］李穎暢，宜景宏，孟憲軍.藍莓果實中花色素苷的研究進展［J］.食品研究與開發(fā)，2007，28(1):178-180.

［5］Li R，Wang P，Guo QQ，et al.Anthocyanin composition and content of the Vaccinium uliginosum berry［J］.Food Chemistry，2011，125(1):116-120.

［6］Torri E，Lemos M，Caliari V，et al.Anti-inflammatory and antinociceptive properties of blueberry extract(Vaccinium corymbosum)［J］.Journal of Pharmacy and Pharmacology，2007，59(4):591-596.

［7］Morazzoni P，Bombardelli E.Vaccinium myrtillus L.［J］.Fitoterapia，1996，67(1):3-29.