棘托竹蓀孢子粉抗氧化活性研究

王彥輝，林陳強，邱宏端 ，陳濟琛，林新堅*

1福州大學生物科學與工程學院，福州350008;2福建省農科院土壤與肥料研究所，福州350001

竹蓀是一種名貴的食用真菌，其營養(yǎng)豐富，香味濃郁，滋味鮮美，歷史上列為“宮廷貢品”、“菌中皇后”?，F代醫(yī)學研究證明，竹蓀具有滋補強壯、益氣補腦、寧神健腦之功效，且含有能抑制腫瘤的成分。竹蓀子實體主要可分為三大部分:菌蓋、菌體和菌托。菌蓋上著生的孢體，約占竹蓀子實體干重的12%。竹蓀具有抗氧化活性，對其活性成分的研究主要集中在竹蓀菌體抗氧化活性。Yang-Lin Hua通過水提、凝膠過濾純化竹蓀多糖，發(fā)現其具有較強的體內抗氧化活性［1］。Jeng-Leun Mau等研究了包括竹蓀在內的四種特殊食用菌的抗氧化活性，發(fā)現竹蓀甲醇提取物抗氧化活性最高［2］。莊永亮等發(fā)現紅托竹蓀菌蓋多糖具有較強的還原能力和抑制羥基自由基的能力，且隨濃度升高抑制羥基自由基的能力相應提高［3］。李波等發(fā)現七種云南產食用菌中竹蓀的甲醇提取物抗氧化活性較突出，其總酚含量為15.44 mg/g［4］。江玉姬等對26種食用菌子實體水提和醇提液進行了總還原能力、羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基的清除能力測定發(fā)現竹蓀的綜合抗氧化活性較高，且水提活性相比醇提高［5］。然而，對于竹蓀孢子抗氧化的作用至今未見報道，本文擬通過其抗氧化的作用研究，提高竹蓀資源利用率，研發(fā)新產品。

1 材料與儀器

1．1 材料

棘托竹蓀(Dictyophora echino-volvata Zane)，2012年6～9月源于福建省順昌縣。

1．2 儀器與設備

紫外可見分光光度計［UV-2800AH型，尤尼柯(上海)儀器有限公司］;電子分析天平(AR1530，美國);超低細菌型超純水器(SPW-10TJ型，上海賽鴿電子科技有限公司);低速大容量離心機(DL-5型，上海安亭科學儀器廠);旋轉蒸發(fā)器(R209型，上海申生科技有限公司);循環(huán)水多用式真空泵(SHBB95型，鄭州長城科工貿有限公司);低溫冷卻液循環(huán)泵(DL1030型，上海申生科技有限公司)。實驗所用有機試劑購于國藥集團。

2 實驗方法

2．1 竹蓀孢子收集與破壁竹蓀孢子制備

2．1．1 竹蓀孢子收集

采集新鮮的竹蓀，將菌蓋剝離，用純水洗滌，過濾，5000 rpm離心5 min，將獲得孢子烘干，過篩;竹蓀破壁孢子粉，由福建省仙芝樓生物公司破壁，破壁率達90%以上。

2．1．2 孢子粉水提液制備

分別精確稱取破壁與未破壁竹蓀孢子粉1 g于50 mL錐形瓶，料液比1∶30加入超純水，室溫條件下超聲震蕩10 min后于90℃水浴中浸提3 h，5000 rpm離心5 min，上清轉移至50 mL容量瓶中，沉淀按上述步驟再次浸提，離心，合并濃縮，定容至50 mL。

2．1．3 孢子粉醇提液制備

分別精確稱取破壁與未破壁的竹蓀孢子粉1 g于50 mL錐形瓶，80%乙醇，料液比1∶30，室溫條件下超聲震蕩10 min后于80℃水浴中回流提取3 h，5000 rpm離心5 min上清轉移至50 mL容量瓶中，沉淀按上述步驟再次浸提，離心，合并濃縮，定容至50 mL。

2．2 抗氧化活性測定

2．2．1 DPPH自由基清除能力測定

參照Vattem等的方法［6，7］進行。吸取竹蓀孢子粉的水提液和醇提液2 mL(初提液稀釋10倍)于20 mL比色管中，加入2 mL 60μmol/L DPPH溶液，搖勻，室溫避光放置30 min，于517 nm測吸光度(As)，空白對照為2 mL水或醇加2 mL 60μmol/L DPPH溶液(Ao)，以2 mL樣品加入2 mL雙蒸水或醇作為樣品對照(Ax)，消除樣品顏色的干擾，陽性對照為抗壞血酸(Vc)。每個樣品重復三次取平均值。清除率R按下式計算:

R=［1-(As-Ax)/Ao］×100%

2．2．2 羥基自由基清除能力測定

參照陳留勇的水楊酸法［8］，并略作改動。反應體系中含 2 mL 6 mmol/L H2O2，2 mL 6 mmol/L FeS04，2mL 6 mmol/L水楊酸-乙醇溶液，待測溶液2 mL，H2O2最后加入啟動反應。36～37℃水浴反應30 min后，12000 rpm離心6 min，以水為參比在510 nm下測定吸光度，重復三次取平均值(Ax)。空白對照(Ao)為2 mL雙蒸水或醇代替待測溶液。以2 mL 6 mmol/L FeS04，2 mL 6 mmol/L 水楊酸-乙醇，2 mL待測溶液和2mL雙蒸水或醇作為樣品對照消除樣品顏色的干擾(Axo)。陽性對照為抗壞血酸(Vc)。清除率R計算公式為:

R=(Ao-(Ax-Axo))/Ao×100%

其中Ao為空白對照吸光度，Ax為加入待測溶液后的吸光度，Axo為待測溶液的本底吸收值。

2．2．3 總還原力測定

總還原力測定參考 Oyaizu(1988)法［9，10］，并略作改進。取樣品溶液0．2 mL，加2 mL 0．2 mol/L、pH 6．6磷酸緩沖溶液和2 mL 1%鐵氰化鉀(K3Fe(CN)6)溶液于1．5 mL離心管中混勻。50℃水浴20 min，加2 mL 0．4 mol/L 三氯乙酸溶液，5000 r/min離心10 min，取上清液2 mL加2 mL蒸餾水和0．4 mL 0．02%三氯化鐵(FeC13)溶液，混合均勻，室溫下反應10 min，700 nm下檢測吸光度。三次重復取平均值，陽性對照為抗壞血酸(Vc)。

2．2．4 超氧陰離子自由基清除能力測定

根據張志軍的方法［11］，3 mL pH 8．2 Tris-HCl緩沖液和1 mL待測樣品，25℃水浴20 min后加入3 mL 7 mmol/L的鄰苯三酚，反應4 min后加10 mol/L HCl終止反應，以Tris-HCl緩沖液作參比，在420 nm處測吸光度，三次重復取平均值，對照組(Ao)以蒸餾水或醇代替，空白組(Axo)為不加鄰苯三酚，陽性對照為抗壞血酸(Vc)。

清除率R=(Ao-(Ax-Axo))/Ao×100%

其中Ao為空白對照吸光度，Ax為加入待測溶液后的吸光度，Axo為待測溶液的本底吸收值。

2．2．5 對Fe2+的螯合能力測定

參考 Decker等的方法［12，13］并作適當修改，移取1 mL樣品，加2．5 mL提取溶劑混勻，各加0．1 mL 2 mmol/L FeCl2溶液充分混勻，加0．2 mL 5 mmol/L Ferrozine溶液混勻反應10 min，在波長562 nm處測定其吸光度，重復三次取平均值，以1mL雙蒸水或醇代替樣品作為對照組(Ao)，空白組(Axo)不加FeCl2，EDTA-Na2為陽性對照。

螯合力R=(Ao-(Ax-Axo))/Ao×100%

其中Ao為空白對照吸光度，Ax為加入待測溶液后的吸光度，Axo為待測溶液的本底吸收值。

2．3 粗多糖含量測定

參考NY/T1676-2008食用菌中粗多糖含量的測定。

2．4 總多酚含量測定［14］

分別移取沒食子酸標準液(20、40、60、80、100 μg/mL)、水、待測提取液各1 mL于20 mL比色管中，在每個試管中內分別加入5．0mL 10%福林酚試劑，搖勻，反應5 ～8 min，加入4．0 mL 7．5%Na2CO3溶液，加水定容至刻度，搖勻，室溫下放置60 min，765 nm下測定吸光度。以沒食子酸標準液濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制標準曲線。

2．5 總黃酮含量測定

分別吸取 0、2、4、6、8、10 mL 蘆丁標準液(0．1 mg/mL)及10 mL待測提取液于25 mL容量瓶中，加水至10 mL，加入5%亞硝酸鈉1 mL搖勻后靜置6 min，加入10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻后靜置6 min，再加入1 mol/L NaOH溶液10 mL，用60%的乙醇溶液定容至25 mL，靜置12 min后，在510 nm處測定其吸光度。以蘆丁濃度為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標繪制標準曲線。

2．6 不同萃取溶劑對破壁竹蓀孢子粉提取物抗氧化活性影響

竹蓀孢子粉水提液分別用石油醚、正丁醇、氯仿和甲醇萃取，合并減壓濃縮定容至50 mL，DPPH法檢測抗氧化活性。

2．7 破壁竹蓀孢子粉粗多糖的提取及抗氧化活性測定

稱取破壁竹蓀孢子粉，料液比1∶30，90℃水浴浸提3 h，5000 rpm離心5 min，沉淀再次浸提，合并減壓濃縮后加入三倍體積的95%乙醇溶液，4℃過夜，5000 rpm離心5 min取沉淀，真空冷凍干燥至恒重即為竹蓀孢子粗多糖。配制不同濃度的粗多糖溶液，DPPH法檢測抗氧化活性。

3 結果與分析

3．1 竹蓀孢子粉抗氧化能力

3．1．1 竹蓀孢子粉提取物對DPPH自由基清除能力

竹蓀孢子粉提取物稀釋10倍，對DPPH自由基清除力見圖1。由圖可知，DPPH的清除能力破壁-醇提(PC)＞破壁-水提(PH)＞未破壁-醇提(WH)＞未破壁-水提(WC)，對數據進行多重比較(P＜0.05)，結果表明，竹蓀孢子粉乙醇提取物對DPPH自由基清除能力與水提物之間無顯著性差異，破壁處理后的提取物(PC、PH)與未破壁處理(WH、WC)有顯著性差異，其中破壁-醇提(PC)清除能力可達75．56%，抗壞血酸(VC)當量為 583．3 μg/g。未破壁醇提提物DPPH自由基清除效果相比水提物有顯著性差異，說明破壁處理的竹蓀孢子粉更有利于DPPH抗氧化活性物質的提取，且竹蓀孢子粉水溶性和脂溶性的活性物質都具有較強的DPPH自由基清除效果。

3．1．2 羥基自由基清除能力

如圖2所示，竹蓀孢子粉對羥基自由基的清除力:破壁-醇提(PC)＞未破壁-醇提(WC)＞破壁-水提(PH)＞未破壁-水提(WH)，破壁-醇提(PC)的清除率可達54．36%，抗壞血酸(VC)當量為11．87 mg/g。可見，無論是醇提還是水提，破壁竹蓀孢子粉羥基自由基清除效果顯著高于未破壁樣品，醇提效果明顯高于水提，表明孢子粉中脂溶性的活性物質對羥基自由基的清除效果更強。

3．1．3 總還原力

采用鐵氰化鉀法測定竹蓀孢子粉提取物還原力結果如圖3所示，竹蓀孢子粉粗提液的總還原力:破壁-水提(PH)＞破壁-醇提(PC)＞未破壁-水提(WH)＞未破壁-醇提(WC)，可以看出，竹蓀孢子粉提取液的總還原力水提液比醇提液高，可能是水提液有還原糖的存在，破壁-水提(PH)的總還原力為1．090，抗壞血酸(VC)當量為 2．701 mg/g。破壁孢子粉與未破壁孢子粉相比具有較強的還原力。

3．1．4 超氧陰離子自由基清除能力

竹蓀孢子粉提取物對超氧陰離子的清除能力如圖4所示。清除力依次為破壁-水提(PH)＞破壁-醇提(PC)＞未破壁-水提(WH)＞未破壁-醇提(WC)，由圖看出，破壁孢子粉水提和醇提對超氧陰離子自由基的清除率都可以達到80%以上，其中破壁-水提(PH)清除率為88．10%，VC當量為 23．43 mg/g。竹蓀孢子粉的多糖等水溶性成分對超氧自由基清除率與醇提脂溶性物質對超氧陰離子自由基清除能力都較強，水提相比醇提有顯著性差異;破壁與未破壁的相比，破壁竹蓀孢子粉無論醇提還是水提對超氧自由基的清除效果都顯著高于未破壁孢子粉，可能由于破壁樣品有利于竹蓀孢子超氧陰離子清除物質的提取。

3．1．5 Fe2+的螯合力

如圖5所示，Fe2+的螯合力大小依次為破壁-醇提(PC)＞未破壁-醇提(WC)＞破壁-水提(PH)＞未破壁-水提(WH)，水提液對Fe2+的螯合力較低，醇提液的效果較好，其中破壁-醇提(PC)螯合力為68．10%，EDTA-Na2當量為 2．105 mg/g?？梢娭裆p孢子粉脂溶性成分更容易與Fe2+螯合阻止Fenton反應的發(fā)生。

3．2 竹蓀孢子粉粗多糖含量

竹蓀孢子抗氧化活性物質除小分子物質外，粗多糖也具有抗氧化活性。采用國標的方法測定竹蓀孢子粗多糖含量，結果表明，破壁竹蓀孢子粉的多糖含量為8．61 g/100 g，未破壁竹蓀孢子的粗多糖含量為5．66 g/100 g，破壁竹蓀孢子能提高粗多糖含量。

3．3 竹蓀孢子粉總多酚含量

以沒食子酸為陽性對照，得回歸方程 y=0.0047x+0．0141(r=0．9991)，說明沒食子酸濃度在20～100μg/mL時線性關系良好。根據標曲換算樣品多酚含量，由表1可知，通過福林酚的方法測定，不同的處理不同的提取方法，多酚的含量也不相同，其多酚含量破壁-水提(PH)＞未破壁-水提(WH)＞破壁-醇提(PC)＞未破壁-醇提(WC)，其中破壁-水提(PH)總多酚含量為5．531 mg/g為最高。

3．4 竹蓀孢子粉總黃酮含量測定

本實驗采用蘆丁為對照品，以蘆丁濃度為橫坐標，510 nm處吸光值為縱坐標，得回歸方程y=0.5257x+0．0041(r=0．9997)，根據回歸方程計算樣品總黃酮含量。由表1可以看出，竹蓀孢子粉的黃酮含量破壁-水提(PH)＞破壁-醇提(PC)＞未破壁-水提(WH)＞未破壁-醇提(WC)，其中水提(PH)優(yōu)于醇提(PC)，破壁高于未破壁，破壁-水提黃酮含量為3．271 mg/g。

表1 竹蓀孢子粉總多酚與總黃酮含量Table 1 Total polyphenols and flavonoids of D．echinovolvata spore

3．5 不同萃取溶劑對破壁竹蓀孢子粉提取物抗氧化活性的影響

分別用石油醚、正丁醇、氯仿和甲醇對水提浸膏進行萃取，DPPH自由基清除率檢測抗氧化活性，結果發(fā)現，如圖6所示，四種有機溶劑萃取中甲醇萃取對DPPH自由基清除率最大，為63．10%，其次為正丁醇、氯仿，石油醚DPPH清除率為1．59%。與水提相比，甲醇萃取液的抗氧化活性下降15%，說明破壁竹蓀孢子粉水提液中可能存在抗氧化活性多糖等一些水溶性活性物質。相同濃度條件下，不同極性有機溶劑萃取中正丁醇相抗氧化活性相對較強，可作為竹蓀孢子粉小分子抗氧化活性物質分離純化的萃取溶劑。

3．6 破壁竹蓀孢子粉粗多糖抗氧化活性

通過水提醇提的方法得到竹蓀孢子粉粗多糖，分別配制 0．1、0．2、0．3、0．4、0．5 mg/mL 粗多糖溶液進行DPPH自由基清除力抗氧化活性檢測，發(fā)現如圖7所示，粗多糖0．1 mg/mL時對DPPH自由基清除力為30．86%，隨著竹蓀孢子粉粗多糖濃度的增大，DPPH自由基清除力也逐漸增大，0．5 mg/mL時DPPH自由基清除力可達83．66%，說明竹蓀孢子粉粗多糖具有較好的DPPH清除效果。

4 結論

本研究采用DPPH自由基清除率、羥基自由基清除率、還原力、超氧自由基清除率和對Fe2+的螯合力對竹蓀孢子粉的抗氧化效果進行評價。實驗結果發(fā)現，五種模型對不同處理不同提取方法的評價效果不同。通過統(tǒng)計分析，除DPPH自由基外，破壁樣品水提和醇提對超氧自由基清除率、羥基自由基清除率、Fe2+的螯合力及還原力有顯著差異，破壁處理后的竹蓀孢子粉與未破壁的竹蓀孢子粉相比具有較顯著的抗氧化活性，說明破壁竹蓀孢子粉更有利于活性物質的提取。針對竹蓀孢子粉的抗氧化活性，初步檢測了與抗氧化可能有關的活性成分，其中破壁-水提樣品粗多糖含量可達8．61 g/100 g，總多酚含量 5．531 mg/g，總黃酮含量 3．271 mg/g。

采用不同極性的有機溶劑對破壁竹蓀水提液進行浸提發(fā)現，甲醇的DPPH自由基清除效果最好，但相對水提液的DPPH自由基清除率下降15%，據此推斷竹蓀孢子粉還存在其他水溶性的抗氧化活性物質，并通過竹蓀孢子粉粗多糖的提取及DPPH自由基清除率的測定，發(fā)現竹蓀孢子粉粗多糖確實有較強的抗氧化活性，且隨著竹蓀孢子粗多糖濃度的增大，其DPPH自由基清除率也相應增大。相同濃度條件下，不同極性有機溶劑萃取液中正丁醇對竹蓀孢子粉水提浸膏萃取效率最高。

本論文初步研究了竹蓀孢子粉的抗氧化活性，為竹蓀資源合理利用、竹蓀新產品開發(fā)及提高農產品附加值提供依據。

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