亞臨界丙酮提取萬壽菊渣中抗氧化活性成分的研究

李禹辰，王 迪，樊 蕊，高彥祥，袁 芳

（中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京100083）

萬壽菊為菊科萬壽菊屬一年生草本植物，花色鮮艷，具有很好的觀賞價值。萬壽菊花瓣中富含具有藥用與保健功能的葉黃素。經(jīng)過發(fā)酵、制粒、萃取等生產(chǎn)加工過程提取葉黃素后剩余的大量殘渣，目前常被用作肥料使用，其中的功能成分并沒有得到充分的重視和利用。研究表明，黃酮和多酚類物質均為性能較好的抗氧化劑，可有效清除體內(nèi)的氧自由基，具有抗腫瘤、抗菌、抗衰老等功效[1-2]。亞臨界流體萃取是繼超臨界流體萃取技術之后誕生的新型分離技術，萃取壓力較低，可工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，具有節(jié)能、運行成本低等優(yōu)點[3]。其原理是在適當壓力下，溶劑仍然保持液體狀態(tài)，但與常溫常壓時相比，極性發(fā)生變化，從而可以選擇性地提取不同種類的植物有效成分[4-5]。從萃取效果看，植物活性成分得到了很好的保護[6]。本實驗研究不同丙酮濃度、提取溫度、時間、液固比條件下亞臨界丙酮對萬壽菊渣中抗氧化活性成分提取效果的影響，并采用ABTS+·、DPPH·清除法對提取液的抗氧化活性進行評價。研究結果對萬壽菊的綜合利用，進一步開拓亞臨界萃取技術在食品領域的應用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

萬壽菊顆粒（已脫脂） 山東賽特天然香精有限公司；沒食子酸標品（98%HPLC）、蘆丁標品（98%HPLC）、Folin-ciocalteu’s試劑（2mol/L）、ABTS+·（2，2-Azinobis-（3-ethylbenzothiazolin-6-sulfoni acid））、DPPH·（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl） Sigma公司；無水丙酮、碳酸鈉、亞硝酸鈉、氯化鋁、氫氧化鈉、過硫酸鉀、無水甲醇 分析純，北京化學試劑公司。

CWYF-2型亞臨界水萃取裝置 江蘇華安石油科研儀器設備有限公司，如圖1所示；UV-1800型紫外可見分光光度計 日本島津公司；DSHZ-300型恒溫水浴振蕩器 江蘇太倉市實驗設備廠；TDL-5-A型臺式離心機 上海安亭科技儀器廠；HY-200型中草藥連續(xù)式粉碎機 北京鑫環(huán)亞科技有限公司。

圖1 亞臨界流體萃取裝置Fig.1 Subcritical fluid extractor

1.2 實驗方法

1.2.1 總黃酮含量（total flavonoid content，TFC）的測定 參照文獻[7]略作修改。將適當稀釋的樣品0.5mL、3.5mL去離子水和0.3mL的5%（w/v）亞硝酸水溶液加入到10mL的刻度試管混勻，反應5min，加入3mL的1%氯化鋁水溶液，反應6min，加入2mL的4%（w/v）氫氧化鈉水溶液，用蒸餾水定容至10mL，反應10min，于510nm處測吸光值。用0.5mL的蒸餾水代替0.5mL的樣品作為溶劑空白。以蘆丁為標品，TFC結果用蘆丁當量（Rutin Equivalent，mg RE/g）表示。

1.2.2 總酚含量（total phenolic content，TPC）的測定總酚含量的測定是參照Vatai等的方法[8]進行的。將適當稀釋的樣品0.5mL與2.5mL的0.2N Folin-Ciocalteu試劑混合均勻，反應5min，加入2.0mL的7.5%（w/v）碳酸鈉水溶液，室溫避光反應2h，于747nm處測定吸光度值。用0.5mL蒸餾水代替0.5mL樣品作為溶劑空白。實驗以沒食子酸（Gallic acid，GA）作為標品，TPC結果用沒食子酸當量（mg GAE/g）表示。

1.2.3 原料處理 將萬壽菊顆粒置于室溫下干燥，粉碎機粉碎，篩選40～180目的萬壽菊渣粉末，測得其水分含量為7.11%，其剩余油脂含量為0.82%。

1.2.4 萬壽菊渣中的抗氧化活性成分的單因素實驗

1.2.4.1 丙酮濃度的影響 準確稱取1g脫脂粉碎的萬壽菊渣于萃取釜中，萃取壓力設為5.2MPa，按比例50∶1（v/w）分別泵入濃度為0%、20%、40%、60%、80%的丙酮溶液，120℃下萃取30min，考察不同濃度丙酮對萃取物中總酚、總黃酮含量的影響。

1.2.4.2 提取溫度的影響 準確稱取1g脫脂粉碎的萬壽菊渣于萃取釜中，萃取壓力設為5.2MPa，按比例50∶1（v/w）泵入40%的丙酮溶液，萃取溫度分別為100、120、140、160、180℃，萃取30min，考察不同提取溫度對萃取物中總酚、總黃酮含量的影響。

1.2.4.3 提取時間的影響 準確稱量1g脫脂粉碎的萬壽菊渣于萃取釜中，萃取壓力設為5.2MPa，按比例50∶1（v/w）泵入濃度40%的丙酮溶液，萃取溫度為120℃，分別萃取15、30、45、60、75min，考察不同提取時間對萃取物中總酚、總黃酮含量的影響。

1.2.4.4 液固比的影響 準確稱取1g脫脂粉碎的萬壽菊渣于萃取釜中，萃取壓力設為5.2MPa，分別按液固比10∶1、30∶1、50∶1、70∶1、90∶1（v/w）泵入濃度為40%的丙酮溶液，120℃下萃取30min，考察不同液固比對萃取物中總酚、總黃酮含量的影響。

1.2.5 正交實驗 以單因素實驗為基礎，選取丙酮濃度、溫度、提取時間等對萬壽菊渣中多酚類物質提取率影響較大的因素進行L9（34）正交實驗，以TPC、TFC為評價指標，以得到較優(yōu)的工藝參數(shù)。正交實驗因素與水平見表1。

表1 因素水平表Table 1 Orthogonal factor level table

1.2.6 溶劑振蕩提取法 取1g萬壽菊渣粉末于錐形瓶中，分別用水、60%乙醇、70%丙酮作為萃取劑，置于恒溫水浴搖床（100r/min）中，在50℃下萃取2h，過濾后測定各項指標。

1.2.7 其他亞臨界提取法 亞臨界水：準確稱取1g脫脂粉碎的萬壽菊渣于萃取釜中，萃取壓力設為5.2MPa，分別按液固比50∶1（v/w）泵入去離子水，200℃下萃取45min，考察萃取物中總酚、總黃酮含量及其抗氧化活性。

亞臨界乙醇：準確稱取1g脫脂粉碎的萬壽菊渣于萃取釜中，萃取壓力設為5.2MPa，分別按液固比50∶1（v/w）泵入60%乙醇溶液，140℃下萃取30min，考察萃取物中總酚、總黃酮含量及其抗氧化活性。

1.2.8 樣品提取液清除ABTS+·能力的測定 參考Pellegrini等[9]的方法并進行適當調整。將10mg ABTS+·溶到2.6mL的2.45mmol/L的過硫酸鉀溶液中，室溫避光反應12～16h，制成ABTS+·儲備液。將儲備液經(jīng)過甲醇適當稀釋，使其在734nm處吸光值為0.7±0.02，得到ABTS+·反應液。將1mL適當稀釋樣品與3mL ABTS+·反應液混合均勻，室溫避光反應1h。于734nm處測定吸光度值。3mL甲醇代替3mL ABTS+·反應液作為樣品空白。用1mL蒸餾水代替1mL樣品作為溶劑空白，734nm波長處測定吸光值。結果以Trolox當量（Trolox Equivalent，mmol TE/g）表示。

1.2.9 樣品提取液清除DPPH·能力的測定 參考Ramadan等[10]研究的方法。將DPPH·溶解于甲醇中制成1.75×10-4mol/L的DPPH·反應液。取2mL適當稀釋的樣品與2mL的DPPH·反應液混勻，室溫避光反應1h，于517nm處測定吸光度值。2mL甲醇代替2mL DPPH·反應液作為樣品空白。用2mL蒸餾水代替2mL樣品作為溶劑空白，517nm處測定吸光值。結果以Trolox當量（Trolox Equivalent，mmol TE/g）表示。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果與分析

2.1.1 丙酮濃度對萬壽菊渣萃取物中總酚、總黃酮含量的影響 由圖2可知，丙酮濃度過低或過高對酚類物質和黃酮類物質的萃取影響均不利。丙酮濃度對多酚類物質的萃取有顯著影響（p＜0.05）。丙酮濃度從0%增加到40%時，萃取物中多酚類和黃酮類物質含量上升，用40%丙酮提取時目標產(chǎn)物的含量最高，達到（92.66±1.71）mg GAE/g（總酚）和（109.17±3.62）mg RE/g（總黃酮），之后從40%～80%，目標產(chǎn)物的含量有所降低。因此，可初步認定最佳濃度應在20%～60%。

圖2 丙酮濃度對萬壽菊渣萃取物中總酚、總黃酮含量的影響Fig.2 The effect of different concentration of acetone on TPC and TFC extracts from marigold grounds

2.1.2 溫度對萬壽菊渣萃取物中總酚、總黃酮含量的影響 由圖3可知，萃取物中的總多酚含量和總黃酮含量隨著溫度上升呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當溫度從100℃上升到140℃時，黃酮與總酚的含量上升，但是從140℃上升到180℃時，二者的含量均不斷降低，在140℃時提取物中總酚與總黃酮含量達到最高，分別為（130.79±1.71）mg GAE/g和（111.89±0.63）mg RE/g。這表明在一定溫度范圍內(nèi)隨著溫度升高，多酚類物質在亞臨界丙酮中溶解度也更大。但是當溫度達到180℃時，總酚與總黃酮含量分別下降至（117.58±1.02）mg GAE/g和（107.29±1.89）mg RE/g，這說明溫度大于140℃時，引起了多酚類物質的降解和與其他成分的反應。

圖3 溫度對萬壽菊渣萃取物中總酚、總黃酮含量的影響Fig.3 The effect of different temperature on TPC and TFC of the extracts from marigold grounds

已有研究表明，從植物中得到的膳食纖維含有豐富的多酚類物質[11]。多酚類物質通過酯鍵和醚鍵與蛋白質和多糖鍵合在一起，使得膳食纖維具有了抗氧化活性，而亞臨界條件可以促使膳食纖維水解，從而釋放出更多的多酚類物質[12]。萬壽菊花中含有大量的膳食纖維，因此多酚類物質含量在100℃至140℃時上升，可能是因為酯鍵和醚鍵的斷裂。而當溫度更高時，高溫會破壞酚類物質結構使其分解或與其他成分發(fā)生反應從而使總酚和總黃酮含量降低[13]。因此，可初步認定最佳提取溫度應在120～160℃。

2.1.3 萃取時間對萬壽菊渣萃取物中總酚、總黃酮含量影響 由圖4可知，萃取物中總多酚含量和總黃酮含量隨著時間延長呈現(xiàn)先增加后降低再增加的趨勢，多酚含量在45min達到最大值，而總黃酮含量在30min時最大。從15、30min，萃取物中的總多酚含量分別為（84.27±1.05）mg GAE/g、（98.15±1.23）mg GAE/g，總黃酮含量分別為（97.50±0.76）mg RE/g、（106.79±0.69）mg RE/g。當時間小于30min時，萃取出的多酚類物質隨著時間延長而增加，這可能是由于時間越長，樣品與溶劑的接觸時間更充分，溶出的目標產(chǎn)物更多。但45～60min萃取出的目標物質隨著時間延長而降低，可能是由于45min時溶出率達到平衡，因此時間延長不能提取出更多的目標產(chǎn)物，而亞臨界提取在高溫下進行，長時間的處理使得目標產(chǎn)物多酚類物質發(fā)生降解或聚合，從而使其含量降低。另外，60～75min時總黃酮與總酚的含量上升，可能由于長時間反應引起美拉德反應，中間產(chǎn)物的形成使得結果升高[14]。因此，可初步確定最佳提取時間應在15～45min。

圖4 萃取時間對萬壽菊渣萃取物中總酚、總黃酮含量的影響Fig.4 The effect of different time on TPC and TFC of the extracts from marigold grounds

2.1.4 液固比對萬壽菊渣萃取物中總酚、總黃酮含量的影響 由圖5可以看出，萃取物中總多酚含量和總黃酮含量隨著液固比呈現(xiàn)先增加后降低并趨于穩(wěn)定的趨勢，總酚與總黃酮的含量均在30∶1時達到最大。但總體來說，提取液中總酚與黃酮含量隨液固比的變化幅度很小，液固比對酚類及黃酮類的提取效率影響無顯著性（p＞0.05）。

2.2 正交實驗結果與分析

圖5 液固比對萬壽菊渣萃取物中總酚、總黃酮含量的影響Fig.5 The effect of different liquid to solid ratio on TPC and TFC of extracts from marigold grounds

表2 正交實驗表Table 2 Orthogonal test

正交實驗設計與結果見表2。由黃酮得率的分析結果可知，丙酮濃度對黃酮類的提取效率影響最大，較優(yōu)工藝組合為A3B2C2，即丙酮濃度為60%、溫度為140℃、提取時間30min時提取效果較佳。在驗證實驗中，較優(yōu)組合A3B2C2條件下黃酮類物質的得率為15.03%±0.04%，均高于正交表中的任意組合。

由總酚得率的分析結果可知，提取時間對總酚提取效率的影響最大，較優(yōu)工藝組合為A3B2C2，與黃酮類物質的最佳組合一致。在驗證實驗中，較優(yōu)組合A3B2C2條件下多酚類物質的得率為13.12%±0.07%，均高于正交表中的任意組合。

表3 對比實驗結果Table 3 Comparisons of different extraction methods

綜合二者結果可得，較優(yōu)工藝組合為：丙酮濃度60%，溫度140℃，提取時間30min。用ABTS+·、DPPH·清除法對較優(yōu)條件下提取物的抗氧化活性進行評價，可得其ABTS+·清除能力為（3.18±0.07）mmol TE/g，DPPH·清除能力為（3.42±0.12）mmol TE/g。

2.3 不同萃取方法的比較

傳統(tǒng)的溶劑振蕩浸提法所使用的溶劑有：純水（50℃，2h）、70%乙醇水溶液（50℃，2h）、60%丙酮水溶液（50℃，2h）[15]。對比傳統(tǒng)溶劑振蕩浸提法、亞臨界水（200℃，45min）、亞臨界乙醇（60%，200℃，45min）提取法與亞臨界丙酮方法（60%，140℃，30min）對萃取物中總酚、總黃酮含量及萃取物抗氧化活性的影響見表3。通過對比可以發(fā)現(xiàn)，亞臨界方法可以更有效的提取萬壽菊渣中的抗氧化活性物質。另外，采用亞臨界丙酮的方法可以降低縮短提取時間，且相對亞臨界乙醇和亞臨界水的方法提取溫度有所降低，對生產(chǎn)有利。

3 結論

本實驗研究應用靜態(tài)亞臨界丙酮萃取技術，考察了不同丙酮濃度、萃取溫度、萃取時間、液固比對萃取物中總酚、總黃酮的影響，結論如下：

3.1 單因素實驗考察亞臨界萃取條件包括丙酮濃度、溫度、時間、液固比對總酚、總黃酮含量的影響，發(fā)現(xiàn)最佳提取條件應在以下范圍：丙酮濃度20%～60%，溫度120～160℃，時間15～45min。其中，液固比對提取效率無顯著性影響（p＜0.05），不做進一步研究。通過正交實驗，優(yōu)化出亞臨界丙酮萃取萬壽菊渣黃酮、多酚類化合物的最佳條件為：丙酮濃度60%、溫度140℃、提取時間30min。該條件下總黃酮得率為（15.03%±0.04）%，總酚得率為（13.12%±0.070%，ABTS·+清除能力為（3.18±0.07）mmol TE/g，DPPH·清除能力為（3.42±0.12）mmol TE/g。

3.2 在與其他萃取方法的比較中，相對于水、丙酮、乙醇的振蕩浸提和亞臨界水、亞臨界乙醇萃取，采取本實驗的方法能夠在縮短提取時間、降低提取溫度的情況下，有效提高抗氧化活性成分的得率，為亞臨界提取萬壽菊渣中抗氧化活性成分的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了一定的理論依據(jù)。

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