響應(yīng)面法優(yōu)化紅景天中紅景天苷超聲波-微波協(xié)同提取工藝

曾慶華，樊 琛，孫小凡，李 燕，劉桂芹，王 會

（聊城大學(xué)食品科學(xué)與工程系，山東聊城252059）

紅景天（Rhodiola sachalinensis A.Bor.）屬被子植物門薔薇目景天科（Crassulaceae）紅景天屬（Rhodiola L.），為多年生草本或亞灌木野生植物，其品種繁多，資源豐富，全世界共有90多種，我國約有73種，主要分布在四川、東北、新疆、甘肅、西藏、云南、貴州等地[1-3]。紅景天具有特殊的適應(yīng)性和很強的生命力，素有“高原人參”和“雪山仙草”之稱[4-5]。紅景天全株可入藥，尤以其根莖及根為最佳?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》將紅景天列為藥中上品，2005版第一部《中國藥典》也將紅景天收錄其中，這些都充分證明了紅景天養(yǎng)生保健的藥用價值[6]。

紅景天苷是紅景天的主要有效性成分，也是評價紅景天的最重要指標(biāo)[7-8]?，F(xiàn)代藥理學(xué)表明，紅景天苷具有消除疲勞、抗衰老、抗缺氧、抗微波輻射、抗腫瘤等作用；對神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)起到調(diào)節(jié)作用；改善心血管系統(tǒng)、影響三大物質(zhì)的代謝。另外，紅景天苷還具有調(diào)節(jié)機體免疫及適應(yīng)原樣等作用，被稱為繼人參、刺五加之后的新一代極具發(fā)展?jié)摿Φ沫h(huán)境適應(yīng)藥物，在軍事醫(yī)學(xué)、航空醫(yī)學(xué)、運動保健醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域均具有十分重要的應(yīng)用價值[9-11]。

目前，國內(nèi)外學(xué)者對紅景天的化學(xué)成分、藥理作用、主要有效成分的結(jié)構(gòu)鑒定有較為深入的研究，但對于其提取純化工藝的研究，還處于初始階段[12]。因此，紅景天苷的提純工藝優(yōu)化研究意義重大。已有的科研報道中，對紅景天有效成分的粗提取大多采用溶劑提取法[13]（包括熱提取法和浸泡提取法）、微波輔助法[14]、超聲波提取法[15]、超臨界萃取法[16]等。溶劑提取法耗時較長。超臨界萃取法所得產(chǎn)品質(zhì)量高，但設(shè)備一次性投入較大。微波輔助法與超聲波提取法在紅景天苷提取中的應(yīng)用一般作為單一技術(shù)使用。周明等[17]利用超聲波-微波協(xié)同提取靈芝多糖，結(jié)果超聲波-微波協(xié)同萃取法與常規(guī)熱水提取工藝相比，可減少3/4的提取時間，提高26.27%的提取效率。利用超聲波-微波協(xié)同提取紅景天苷的工藝研究尚未見報道。本實驗利用響應(yīng)面法對超聲波-微波協(xié)同提取紅景天苷的工藝進行優(yōu)化，為超聲波-微波協(xié)同提取紅景天苷產(chǎn)業(yè)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅景天 產(chǎn)地云南，購于聊城市利民中藥飲片有限公司，粉碎后過40目篩備用；紅景天苷對照品 貴州迪達科技有限責(zé)任公司；蒸餾水、95%乙醇、10%醋酸鉛溶液、正丁醇、飽和硫酸鈉溶液 均為分析純。

KQ3200型超聲波清洗器 超聲功率150W，昆山市超聲儀器有限公司；常壓微波合成/萃取工作站 上海新儀微波化學(xué)科技有限公司；TG-16WS型臺式離心機 長沙湘智離心機儀器有限公司；TU-1810型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 檢測波長確定 精密稱取紅景天苷對照品20.1mg，置于100mL的容量瓶中，加蒸餾水定容，并搖勻，即得濃度為0.20g/L的紅景天苷標(biāo)準(zhǔn)溶液。取標(biāo)準(zhǔn)溶液3.0mL置10mL容量瓶中，加蒸餾水定容，并搖勻，在200～400nm波長下掃描[18]。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別量取1.2.1所得紅景天苷標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0﹑2.0﹑3.0﹑4.0﹑5.0﹑6.0mL，放于10mL容量瓶中，用蒸餾水定容，搖勻，在276nm處測定其吸光度。以吸光度Y為縱坐標(biāo)，濃度x為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 紅景天中紅景天苷的提取方法

1.2.3.1 紅景天苷提取工藝流程 紅景天根→粉碎（過40目篩）→超聲波處理→微波提取→抽濾→濾液定容→除雜→離心→定容→測定吸光度。

1.2.3.2 紅景天苷的提取方法 將干燥的紅景天根置于中藥粉碎機中粉碎，過40目篩備用。準(zhǔn)確稱取紅景天粉末5.0000g，置于100mL微波儀專用三頸燒瓶中，加入一定比例的乙醇溶液，在一定條件下超聲一定時間，然后在實驗條件下微波輔助提取一定時間，抽濾得濾液，濾液定容于100mL容量瓶中，搖勻，量取10mL濾液于燒杯中，加入2mL 10%醋酸鉛溶液，搖勻充分反應(yīng)后再加入0.5mL飽和硫酸鈉溶液，搖勻脫鉛。將反應(yīng)液以4000r/min離心15min，取上清液用蒸餾水定容于50mL容量瓶，搖勻。以蒸餾水作參比液，于276nm測定吸光度。

1.2.3.3 紅景天苷得率測定 按照1.2.3.2中的方法做實驗，獲得吸光度值，將此值代入回歸方程y=4.6676x-0.006，得出提取液中有效成分的濃度a（mg/mL）。將此濃度代入公式：紅景天苷的得率（%）=（a×500/b）×100；式中，b代表樣品的質(zhì)量（g）。

1.2.4 單因素實驗 超聲波-微波協(xié)同提取紅景天中紅景天苷的實驗優(yōu)化主要包括乙醇體積分數(shù)、料液比、超聲波時間、微波時間、微波功率的選擇。針對這幾個因素分別按照1.2.3.2中的方法做單因素實驗，考察它們對得率的影響，選擇最佳的提取條件。

1.2.4.1 乙醇體積分數(shù)的選擇 固定料液比1∶20，超聲波時間20min，微波時間10min，微波功率400W，在乙醇體積分數(shù)分別為10%、30%、50%、70%、90%的條件下提取。

1.2.4.2 料液比的選擇 固定乙醇濃度70%，超聲波時間20min，微波時間10min，微波功率400W，分別在料液比為1∶10﹑1∶15﹑1∶20﹑1∶25﹑1∶30的條件下提取。

1.2.4.3 超聲時間選擇 固定乙醇體積分數(shù)70%，料液比1∶20，微波時間10min，微波功率400W，分別在超聲波時間為10﹑20﹑30﹑40﹑50min的條件下提取。

1.2.4.4 微波時間選擇 固定乙醇體積分數(shù)70%，超聲波時間20min，料液比1∶20，微波功率400W，分別在微波時間為6、8、10、12、14min的條件下提取。

1.2.4.5 微波功率選擇 固定乙醇體積分數(shù)70%，料液比1∶20，超聲波時間20min，微波時間10min，分別在微波功率為300、400、500、600、700W的條件下提取。1.2.5 響應(yīng)面實驗 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取乙醇體積分數(shù)、料液比、微波時間作為自變量進行3因素3水平中心組合實驗設(shè)計，對紅景天苷的提取工藝進行優(yōu)化。水平因素設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面實驗因素水平表Table 1 Analytical factors and levels for RSA

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長確定

吸收光譜如圖1所示，紅景天苷標(biāo)準(zhǔn)溶液在221nm和276nm處具有最大吸收峰，但供試品溶液在221nm附近存在干擾性雜質(zhì)[19]，對吸光度的穩(wěn)定性有影響，因此，本文選擇以276nm作為紅景天苷有效成分的檢測波長。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，吸光度（Y）與紅景天苷濃度（x，mg/mL）的線性回歸方程為：Y=4.6676x-0.006，R2=0.9997，其中，Y與x在0～0.12mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.3 單因素實驗

圖1 紅景天苷標(biāo)準(zhǔn)溶液紫外吸收光譜圖Fig.1 UV absorption spectra of the standard salidroside solution

圖2 紅景天苷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curves of the standard salidroside solution

2.3.1 乙醇體積分數(shù)對紅景天苷得率的影響 由圖3可知，紅景天苷得率隨著乙醇體積分數(shù)的增加而有所提高，但超過70%以后有所下降。因此選擇乙醇體積分數(shù)70%作為最佳提取濃度。濃度過高或過低都不利于有效成分的提取，這是因為濃度較大時，過高的滲透壓使溶劑不易滲入紅景天組織細胞壁和細胞膜，而濃度過低又不利于有效成分的溶解和吸收所導(dǎo)致的。

圖3 乙醇體積分數(shù)對紅景天苷得率的影響Fig.3 Effect of volume fraction of ethanol on the yield of salidroside

2.3.2 料液比對紅景天苷得率的影響 由圖4可知，在料液比為1∶10～1∶20的區(qū)間內(nèi)，隨著溶媒量的增加，紅景天苷得率逐漸增大，因為在此液料比范圍內(nèi)，浸提用的溶劑量還不足以溶解浸出的紅景天苷，提取液已達到飽和；但在料液比1∶20以后增加不明顯，另一方面，溶媒量增加，生產(chǎn)成本及后續(xù)處理的難度也會增大，考慮到經(jīng)濟效益和抽濾時間，因此選用1∶20的料液比作為最佳料液比。

圖4 料液比對紅景天苷得率的影響Fig.4 Effect of liquid-solid ratio on the yield of salidroside

2.3.3 超聲波時間對紅景天苷得率的影響 由圖5可知，隨著超聲時間的增加，紅景天苷得率不斷增加，但超過30min后不斷減小，考慮到提取時間和經(jīng)濟效益，因此選擇20min作為最佳超聲波提取時間。分析原因為：在一定時間范圍內(nèi)，隨超聲波提取時間的延長，樣品中的含水量增加，加快了固相中紅景天苷向水中的溶解，使紅景天苷的浸出更充分；而超聲波時間過長，則會導(dǎo)致紅景天苷水解進程的加快，從而使提取率有所下降。

圖5 超聲波時間對紅景天苷得率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic wave extraction time on the yield of salidroside

2.3.4 微波時間對紅景天苷得率的影響 由圖6可知，隨著微波時間的增加，紅景天苷得率基本不變，超過10min以后有所下降。因此選擇10min作為最佳微波提取時間。

圖6 微波時間對紅景天苷得率的影響Fig.6 Effect of microwave extraction time on the yield of salidroside

2.3.5 微波功率對紅景天苷得率的影響 由圖7可知，紅景天苷得率隨著微波功率的增加而有所提高，但超過400W以后有所下降。因此選擇微波功率400W作為最佳微波功率。

圖7 微波功率對紅景天苷得率的影響Fig.7 Effect of microwave power on the yield of salidroside

2.4 響應(yīng)面分析實驗

乙醇體積分數(shù)（X1）、料液比（X2）、微波時間（X3）編碼值與實驗值間的轉(zhuǎn)換公式為：X1=（Z1-70）/10，X2=（Z2-20）/5，X3=（Z3-10）/2。式中Z1、Z2、Z3分別表示乙醇體積分數(shù)、料液比、微波時間的真實值。以X1、X2、X3為自變量，紅景天苷得率為響應(yīng)值，采用SAS RSREG程序進行響應(yīng)面分析實驗，實驗設(shè)計與結(jié)果如表2所示。采用SAS 8.0軟件處理上述實驗設(shè)計所得響應(yīng)面圖見圖8～圖10。

由圖8可知，當(dāng)微波提取時間一定時，得率隨乙醇體積分數(shù)和料液比的增加顯示增加，在到達最高點后，下降明顯。

由圖9可知，當(dāng)料液比一定時，得率隨乙醇體積分數(shù)和微波提取時間的增加顯示增加，在到達最高點后，下降明顯。

由圖10可知，當(dāng)乙醇體積分數(shù)一定時，得率隨料液比和微波提取時間的增加顯示增加，在到達最高點后，下降明顯。

表2 響應(yīng)面分析方案及數(shù)據(jù)結(jié)果Table 2 Program and experimental results of RSA

圖8 乙醇體積分數(shù)和料液比對得率影響的響應(yīng)面分析Fig.8 Response surface analysis of volume fraction of ethanol and solid-liquid ratio on the yield of salidroside

圖9 乙醇體積分數(shù)與微波提取時間對得率影響的響應(yīng)面分析Fig.9 Response surface analysis of volume fraction of ethanol and microwave extraction time on the yield of salidroside

圖10 料液比與微波提取時間對得率影響的響應(yīng)面分析Fig.10 Response surface analysis of solid-liquid ratio and microwave extraction time on the yield of salidroside

采用SAS RSREG程序?qū)憫?yīng)值與各因素進行回歸擬合后，得到回歸方程：

Y=2.208333-0.00375X1+0.008X2+0.00225X3-0.050542X12+0.00225X1X2+0.00225X1X3-0.061542X22+0.01375X2X3-0.042042X32

由表3可見，X22為高度顯著，X12，X32為顯著。同樣對響應(yīng)值具有較大影響，進一步說明各具體實驗因子對響應(yīng)面的影響不僅僅是簡單的線性關(guān)系，使用該方程模擬真實的三因素三水平的分析是可行的。由表3可知，回歸模型也是顯著的。該模型相關(guān)系數(shù)R2=0.9017，說明該模型與實際實驗擬合較好。

表3 回歸方程的方差分析結(jié)果Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

因此，回歸方程可以較好地描述各因素與得率之間的真實關(guān)系，可以利用該回歸方程確定最佳工藝條件。經(jīng)過計算得到最佳乙醇體積分數(shù)為70.39533%，料液比為1∶20.350535，微波提取時間為10.078562?？紤]到實驗儀器的實際限制，將其修正為乙醇體積分數(shù)為70%，料液比為1∶20，微波時間為10min，即紅景天苷最佳提取條件為：乙醇體積分數(shù)為70%，料液比為1∶20，微波時間為10min。用此數(shù)學(xué)模型預(yù)測最佳條件下的得率為2.21%。

2.3 驗證實驗

為進一步精確實驗結(jié)果，按照1.2.3.2中的方法做三次驗證實驗，紅景天苷的得率平均可達2.209%，而擬合的數(shù)學(xué)模型得到的理論預(yù)測值為2.21%。驗證實驗結(jié)果表明，該模型擬合效果較好，可以得到準(zhǔn)確可靠的提取工藝參數(shù)。

3 結(jié)論

本文主要以大花紅景天的根為原料，以乙醇為溶媒，采用超聲協(xié)同微波的方法提取紅景天苷，優(yōu)化紅景天苷的提取工藝。在單因素實驗的基礎(chǔ)上，利用中心組合實驗設(shè)計對紅景天苷的提取工藝進行優(yōu)化，采用三因素三水平實驗設(shè)計，根據(jù)回歸分析確定工藝影響因子，以紅景天苷提取率為響應(yīng)值做響應(yīng)面圖，在分析各個因素的顯著性和交互作用后，得出最佳提取工藝條件為：乙醇體積分數(shù)70%，料液比1∶20，超聲波時間20min，微波時間10min，微波功率400W，在此條件下提取3次，得到紅景天苷的平均得率為2.21%。綜上，采用超聲協(xié)同微波的方法提取紅景天苷取得了較好的效果，為工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

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