黑牛肝菌多糖對小鼠酒精性腎損傷保護(hù)作用的研究

趙云霞，陶眀煊，*，程光宇，郭永月，邢 佳，彭 婕

（1.南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇南京210097；2.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇南京210046）

過量飲酒是當(dāng)今世界范圍內(nèi)一個重要的公共衛(wèi)生問題，長期大量飲酒會導(dǎo)致許多臟器系統(tǒng)的損害[1]。肝臟是酒精代謝的主要器官，也是最容易受損的器官。腎臟是僅次于肝臟的乙醇排泄器官。機(jī)體攝入酒精后約10%在腎臟代謝，這些水溶性外源物質(zhì)在腎臟細(xì)胞和間質(zhì)內(nèi)積聚、濃縮，對腎臟可能造成一定程度的損害[2]。目前，國內(nèi)外有關(guān)酒精性肝損害的研究已較為深入，但對酒精性腎損害研究報道較少[3-6]。有研究表明，乙醇可導(dǎo)致以腎小管-間質(zhì)損害為主的病理改變，進(jìn)而可進(jìn)展至腎間質(zhì)纖維化、慢性腎功能衰竭[7-10]。

黑牛肝菌（Boletus aereus，BA）是云南省資源較豐富的一種野生食用菌，其味道鮮美，具有很高的食用和藥用價值。研究表明[11-13]，黑牛肝菌富含蛋白質(zhì)、維生素、多糖、氨基酸和各種礦物質(zhì)元素，對高血壓，高膽固醇和高血脂等疾病均有較好的功效。本研究以黑牛肝菌為原材料，探討了黑牛肝菌多糖對酒精所致小鼠腎損傷的保護(hù)作用，旨在為保健食品或天然藥物的研制和開發(fā)提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑牛肝菌子實體干品 購自云南麗江市古城區(qū)喜瑪拉雅貿(mào)易有限責(zé)任公司，經(jīng)去雜質(zhì)，剪去含培養(yǎng)基的根部，于60℃低溫烘干后粉碎，過60目篩。將細(xì)粉經(jīng)熱水提取、濃縮、乙醇沉淀（1∶4，m/v）、低溫干燥等步驟后，得到粗多糖，粗多糖經(jīng)Sevage法脫蛋白、透析、乙醇沉淀、低溫干燥后得黑牛肝菌精多糖，經(jīng)測定多糖含量約為75.02%，蛋白含量為2.11%；ICR雄性小鼠 6周齡左右，體重（25.75±1.65）g，動物實驗在江蘇省中醫(yī)院動物飼養(yǎng)中心進(jìn)行，動物飼養(yǎng)許可證號（SYXK（蘇）2012-0047）；四乙氧基丙烷 Fluka公司；谷胱甘肽（GSH）、牛血清白蛋白（BSA） Sigma公司；NBT、DTNB 南京卓爾生化有限公司；硫代巴比妥酸（TBA）、過氧化氫等生化試劑 為國產(chǎn)分析純。

GL-22M型高速冷凍離心機(jī) 湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司；722型可見分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司；恒溫水浴鍋 金壇市杰瑞爾電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 造模 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3d，每組10只，隨機(jī)分為模型組、藥物組（聯(lián)苯雙酯組，150mg/kg bw）、RPBA各劑量組（100、200、400mg/kg bw），另取10只健康小鼠為空白對照組。受試樣品用蒸餾水配制，每天灌胃一次，連續(xù)灌胃30d，實驗期間供給全價顆粒飼料，不限制飲食飲水，空白對照組和模型組每天灌等體積的生理鹽水。實驗至第31d，各組動物禁食不禁水12h后，模型組、藥物組及RPBA各劑量組以12mL/kg的量，灌以50%的乙醇溶液，建立動物急性肝損傷模型，空白組灌予等體積的生理鹽水。各組小鼠均在灌胃12h后取腎臟測定各項抗氧化指標(biāo)。

1.2.2 腎勻漿的制備 準(zhǔn)確稱取0.1g腎臟，用生理鹽水洗去污血后拭干，剪碎并加入0.9mL預(yù)冷的50mmol/L磷酸緩沖液（pH7.8），于冰水浴中進(jìn)行超聲破碎（400W，20s×3）制成10%腎勻漿。腎勻漿于4℃條件下10000r/min離心10min，一部分上清液用于測定MDA、GSH含量，另一部分上清液以3∶1的比例加飽和硫酸銨溶液，同樣條件下離心上清液即為粗酶液，用于測定SOD、CAT、GSH-Px活性。

1.2.3 超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定 測定方法在Stewert和Bewly[14]NBT光還原法的基礎(chǔ)上，略有改進(jìn)。取1mL的緩沖液（空白組）、組織粗酶液（樣品組）加入4mL NBT反應(yīng)液中，照光3～5min，以加入緩沖液的避光的反應(yīng)液作為空白對照，在722分光光度計上，于560nm波長測定各組的吸光度值。

1.2.4 谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性的測定 測定方法在Yao Ping等[15]DTNB法的基礎(chǔ)上，略有改進(jìn)。測定時取0.4mL 1.0mmol/L GSH+0.4mL 10%組織勻漿液作為樣品管，取0.4mL 1.0mmol/L GSH+0.4mL雙蒸水作為非酶管，37℃水浴預(yù)溫5min，分別加入0.2mL預(yù)熱的H2O2，3min后加4mL偏磷酸沉淀液，3000r/min離心10min，分別取上清液2mL+2.5mL 0.32mol/L Na2HPO4+0.5mL DTNB顯色液；另取0.4mL雙蒸水+1.6mL+2.5mL 0.32mol/L Na2HPO4+0.5mL DTNB顯色液作空白管?；靹颍覝胤胖?0min后，以蒸餾水為空白對照，于420nm處測定吸光度。

1.2.5 過氧化氫酶（CAT）活性的測定 CAT活性的測定采用改進(jìn)的紫外分光光度法[16]。

1.2.6 還原性谷胱甘肽（GSH）含量的測定 GSH含量按文獻(xiàn)[17]測定，略有改進(jìn)。取10%肝勻漿0.5mL加4%磺基水楊酸0.5mL混勻，室溫下3500r/min離心10min。取0.5mL上清液+4.5mL DTNB做測定管；另取0.5mL 4%磺基水楊酸+4.5mL DTNB做空白管?；靹?，室溫放置10min后，以空白管為空白對照，于420nm處測定吸光度。

1.2.7 過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量的測定 MDA含量的測定采用改進(jìn)的硫代巴比妥酸（TBA）法[18]。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析 實驗數(shù)據(jù)用DPS 13.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，單因素方差分析檢驗組間顯著性差異，數(shù)據(jù)用x±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 RPBA對小鼠體重增長的影響及對酒精損傷小鼠一般情況的觀察

由表1可知，造模前后各組小鼠體重沒有顯著性差異，說明酒精對其生長沒有顯著地影響。觀察期造模后的表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)給予50%的乙醇后，小鼠先表現(xiàn)出興奮狀態(tài)，繼而行走不穩(wěn)，搖擺，四肢癱軟，轉(zhuǎn)身困難，半小時后重者嗜睡、醉倒，呼吸急促，此狀態(tài)一直持續(xù)1h左右。空白組小鼠精神良好，食欲旺盛，毛色光滑有光澤；12h后模型組小鼠狀態(tài)普遍較差，精神萎靡不振，毛色粗糙無光澤，活動減少。與模型組相比，陽性對照組、RPBA各劑量組小鼠精神狀態(tài)、毛色和光澤有著顯著改善，這說明RPBA對酒精性損傷有一定的保護(hù)作用。

2.2 RPBA對小鼠腎損傷后SOD、GSH-Px、CAT的活性影響

由表2可見，造模后腎組織中SOD、GSH-Px、CAT的活性均明顯低于空白對照組（p＜0.01），給予RPBA后，SOD、CAT活性呈劑量-效應(yīng)關(guān)系增加，其中中、高劑量組SOD活性已與空白對照組基本相當(dāng)，高劑量組CAT活性已與藥物組水平相當(dāng)；GSH-Px活性雖未達(dá)到藥物組水平，但隨著多糖劑量的上升，GSH-Px的活性逐漸上升，呈一定的量效關(guān)系。說明RPBA能顯著提高小鼠腎臟SOD、GSH-Px、CAT活性，增強(qiáng)機(jī)體清除自由基、H2O2的能力，減輕其對小鼠腎臟的損害作用。

表2 RPBA對小鼠腎SOD、GSH-Px、CAT活性的影響（x±s，n=10）Table 2 Effect of RPBA on SOD、GSH-Px、CAT activity inkidney of mice（x±s，n=10）

2.3 RPBA對小鼠腎損傷后GSH和MDA含量的影響

表3 RPBA對小鼠腎GSH和MDA含量的影響（x±s，n=10）Table 3 Effect of RPBA on GSH and MDA contents in kidney of mice（x±s，n=10）

由表3可見，造模后小鼠腎臟GSH水平顯著低于空白對照組（p＜0.01），給予RPBA后，雖未達(dá)到藥物組水平，但低、中、高劑量組GSH水平均有所增加，并呈一定劑量關(guān)系，說明RPBA能一定程度地提高腎損傷小鼠非酶體系的抗氧化能力；造模后模型組MDA水平高于空白組，呈顯著性差異（p＜0.01），給予RPBA后，多糖各劑量組MDA水平均有顯著降低，其中高劑量組達(dá)到空白對照組水平，說明RPAB能有效改善腎損傷小鼠體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化水平。

3 討論

自由基學(xué)說認(rèn)為，自由基的增多是產(chǎn)生衰老和死亡的重要因素。在正常的生物代謝過程中，細(xì)胞會產(chǎn)生O2-·等自由基，它們可以迅速地被細(xì)胞內(nèi)的防御系統(tǒng)所消除，不造成危害。但在某些異常因素如放射性物質(zhì)、藥物、酒精等的影響下均會引發(fā)正常代謝外的異常自由基反應(yīng)，這些異常自由基反應(yīng)產(chǎn)生的大量自由基不能完全被防御系統(tǒng)所清除，因而就會在細(xì)胞內(nèi)積累并擴(kuò)散至細(xì)胞外，氧化蛋白質(zhì)、核酸和脂肪，從而損害細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。近期研究[19-21]認(rèn)為，自由基與造成腎臟損傷的機(jī)制有關(guān)，深入研究食用菌多糖對體內(nèi)自由基清除活性，將有助于開發(fā)天然高效抗氧化物質(zhì)。

機(jī)體內(nèi)的自由基清除率防御體系主要由抗氧化酶體系和非酶體系組成。SOD、GSH-Px、CAT三種酶組成生物體最主要的抗氧化酶防御體系。它們能有效清除活性氧自由基，終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在抗氧化方面起了重要作用。當(dāng)這些酶活性降低時，會導(dǎo)致自由基積累，破壞細(xì)胞膜的完整性，并引起功能的喪失[22]。GSH是非酶體系中重要的還原產(chǎn)物，它能迅速清除細(xì)胞內(nèi)的氧自由基，有效地防止脂質(zhì)過氧化[23]。MDA是體內(nèi)自由基攻擊脂質(zhì)產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物的代謝最終產(chǎn)物，可間接反映出細(xì)胞損傷的程度[24]。

食用菌多糖能從整體上提高機(jī)體免疫力，尤其是抗氧化，保護(hù)生物膜和延緩衰老作用。國內(nèi)外關(guān)于食用菌多糖抗氧化活性方面的報道已經(jīng)很多，如有平菇多糖、云芝多糖、金頂側(cè)耳多糖、香菇多糖、茶樹菇多糖、雙孢菇多糖、姬菇多糖、猴頭菇多糖等等[25-32]，其中金頂側(cè)耳多糖能顯著提高腎損傷小鼠的SOD等抗氧化酶活性和GSH含量，姬菇多糖在降低腎損傷小鼠MDA水平方面有很好的作用。與上述研究結(jié)果一致，本實驗顯示黑牛肝菌多糖能提高SOD、CAT、GSH-Px的活性，增加腎組織GSH含量，降低腎勻漿MDA含量。其機(jī)制可能是RPBA預(yù)處理可以提前增強(qiáng)機(jī)體的自由基清除防御體系，可以有效地拮抗急性酒精所導(dǎo)致的抗氧化酶活性降低及GSH耗竭，抑制自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，增強(qiáng)脂肪酸在細(xì)胞內(nèi)代謝，保護(hù)細(xì)胞膜，促進(jìn)細(xì)胞的再生和修復(fù)。實驗結(jié)果說明黑牛肝菌多糖在預(yù)防自由基誘發(fā)氧化腎臟組織損傷方面，是具有開發(fā)前景的一種天然的高效抗氧化劑。

4 結(jié)論

從小鼠一般情況觀察，模型組小鼠精神萎靡不振，毛色粗糙無光澤，活動減少，狀態(tài)普遍較差；而飼喂RPBA各劑量組的小鼠精神狀態(tài)、毛色和光澤有著顯著改善。

從體內(nèi)抗氧化方面分析，模型組小鼠腎臟抗氧化酶SOD、GSH-Px和CAT酶活性下降，抗氧化物質(zhì)GSH含量減少，脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA含量增加；而飼喂RPBA各劑量組的小鼠腎臟抗氧化酶SOD、GSHPx和CAT酶活性顯著升高（p＜0.01），且存在一定的劑量關(guān)系，GSH含量隨RPBA劑量的增加逐步恢復(fù)到正常水平；MDA含量顯著降低（p＜0.01）。說明RPBA能顯著提高腎臟中抗氧化酶活性，減少脂質(zhì)過氧化，對小鼠酒精性腎損傷具有明顯的保護(hù)作用。

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