斑玉蕈菌株的IGS2序列和RAPD分析

潘 越，陳 輝，馮志勇，*，陳明杰，汪 虹，張津京

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京210095；2.國(guó)家食用菌工程技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)開發(fā)實(shí)驗(yàn)室，上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，上海201403）

斑玉蕈（Hypsizygus marmoreus）又名真姬菇、蟹味菇、鴻喜菇等，隸屬白蘑科玉蕈屬，是重要的工廠化食用菌之一[1]。斑玉蕈味道鮮美，是一種珍稀食用菌品種，在國(guó)內(nèi)外都受到食用菌生產(chǎn)行業(yè)的重視，其在日本、韓國(guó)和國(guó)內(nèi)上海等地已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了工廠化生產(chǎn)模式，且效益良好。近年來，隨著食用菌市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)的日趨激烈，假劣菌種充斥著市場(chǎng)，極大地影響了整個(gè)產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。為保護(hù)我國(guó)食用菌物種的遺傳資源，迫切需要簡(jiǎn)便、可靠的方法研究斑玉蕈菌株種質(zhì)資源的遺傳多樣性。

在對(duì)真菌rDNA的研究中，通常認(rèn)為IGS2序列是高變區(qū)，該序列變異性大，進(jìn)化較快，可用于真菌種間和種內(nèi)遺傳多樣性研究。Saito等[2]對(duì)16個(gè)香菇商業(yè)栽培菌株的IGS2序列進(jìn)行過研究，表明香菇種內(nèi)菌株間IGS2序列有著顯著的差異。在國(guó)內(nèi)，黃晨陽(yáng)等[3]對(duì)8個(gè)刺芹側(cè)耳菌株的IGS2序列進(jìn)行研究，研究顯示刺芹側(cè)耳不同菌株的IGS2序列有豐富的多樣性。

RAPD技術(shù)是1990年由Williams首先報(bào)道的一種分子標(biāo)記技術(shù)[4]，如今已經(jīng)成為生物種內(nèi)變種和種群差異性研究的通用手段和標(biāo)記。它具有操作簡(jiǎn)單、多態(tài)性高、DNA用量少、信息量大等優(yōu)點(diǎn)。這一方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于草菇[5]、松口蘑[6]、雙孢蘑菇[7]、木耳[8]、杏鮑菇[9]等主要食用菌的菌種資源研究中。在斑玉蕈中，許占伍等[10]使用RAPD技術(shù)成功分析了斑玉蕈單核菌株的遺傳多態(tài)性，為斑玉蕈育種材料的選擇提供了一定的分子水平依據(jù)。

本文擬利用IGS2和RAPD分子標(biāo)記技術(shù)，以20個(gè)不同的斑玉蕈菌株為實(shí)驗(yàn)材料，探討各菌株間的親緣關(guān)系，旨在為斑玉蕈菌株的快速準(zhǔn)確鑒別提供技術(shù)依據(jù)，為斑玉蕈種質(zhì)資源的知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本實(shí)驗(yàn)中斑玉蕈菌株共20份 具體來源見表1；感受態(tài)細(xì)胞 Tiangen公司；PCR試劑、pGEM-T載體TaKaRa公司；Axy Prep DNA試劑盒 愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司；IGS2引物 由上海捷瑞生物工程有限公司合成；RAPD隨機(jī)引物 由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 供試菌株Table 1 Tested strains of Hypsizygus marmoreus

5810R型高速冷凍離心機(jī) Eppendorf；PCR擴(kuò)增儀，Power PAC 3000水平電泳儀，VDS凝膠成像系統(tǒng)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 將低溫保藏的斑玉蕈菌種活化后接種于PDA平板上，25℃暗室培養(yǎng)15～18d，收集菌絲。采用CTAB法[11]提取基因組DNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，使用Nano Drop測(cè)定DNA濃度，將基因組DNA樣品濃度稀釋到50ng/μL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 IGS2分析

1.2.2.1 IGS2片段的擴(kuò)增 使用真菌通用引物5SRNAR/InvSR1R（表2）對(duì)供試菌株進(jìn)行擴(kuò)增。25μL反應(yīng)體系：10×PCR buffer 2.5μL（含Mg2+20mmol/L），dNTPs（2.5mmol/L）2μL，引物（10umol/L）0.5μL，模板DNA（50ng/L）0.5μL，Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.25μL，ddH2O補(bǔ)平至25μL。PCR反應(yīng)條件：94℃3min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1.5min，30個(gè)循環(huán)；72℃7min。4℃保存。

1.2.2.2 擴(kuò)增片段的回收與克隆 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，利用Axy Prep DNA試劑盒進(jìn)行回收，按照PGEM-T Vector試劑盒說明書進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化于大腸桿菌E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，將菌液涂布于含氨芐青霉素的LB平板（含X-gal和IPTG），于37℃倒置培養(yǎng)12～16h，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子送往上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.2.2.3 數(shù)據(jù)分析 對(duì)所得序列中計(jì)算機(jī)誤讀的個(gè)別堿基進(jìn)行人工校對(duì)，校對(duì)后的DNA序列用NCBI BLAST進(jìn)行序列搜索，確定為IGS2序列后，使用DNAStar軟件進(jìn)行序列相似度比對(duì)。

表2 IGS2引物Table 2 Primer of IGS2

1.2.3 RAPD分析

1.2.3.1 引物篩選 從隨機(jī)引物中篩選出對(duì)所有20個(gè)菌株擴(kuò)增效果較好、多態(tài)性高、穩(wěn)定性較強(qiáng)的引物對(duì)樣品進(jìn)行擴(kuò)增。

1.2.3.2 反應(yīng)體系及參數(shù) 25μL反應(yīng)體系：10×PCR buffer 2.5μL（含Mg2+20mmol/L），dNTPs（2.5mmol/L）2μL，引物（10umol/L）0.5μL，模板DNA（50ng/L）2μL，Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.25μL，ddH2O補(bǔ)平至25μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 3min；94℃ 1min，38℃ 1min，72℃ 2min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 7min。4℃保存。PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)：PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，EB染色后，在VDS攝影系統(tǒng)下觀察結(jié)果并拍照。

1.2.3.3 數(shù)據(jù)處理 根據(jù)片段的遷移率及有無（有帶記為1，無帶記為0），統(tǒng)計(jì)得到二元數(shù)據(jù)，轉(zhuǎn)換為數(shù)字矩陣。使用NTSYSpc分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用UPGMA法構(gòu)建遺傳相關(guān)聚類圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 20株斑玉蕈形態(tài)學(xué)特征

選取六株具有代表性的菌株，其子實(shí)體形態(tài)圖見圖1。20株斑玉蕈的形態(tài)學(xué)特征見表3。

圖1 部分菌株的子實(shí)體形態(tài)圖Fig.1 The morphology picture of part strains

2.2 IGS2分析

2.2.1 IGS2-PCR 對(duì)20個(gè)供試菌株的擴(kuò)增結(jié)果顯示，所有菌株均可擴(kuò)增出目的片段，不同菌株間IGS2序列大小沒有顯著差異，均在1200bp左右（圖2）。

2.2.2 IGS2-測(cè)序 測(cè)序結(jié)果表明，不同斑玉蕈菌株的IGS2序列大小存在差異，在1150～1203bp之間，將所有菌株的序列提交到GenBank，登錄號(hào)見表4。使用DNAStar對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)和分析并計(jì)算序列相似性系數(shù)。20個(gè)斑玉蕈菌株的IGS2片段總的變異位點(diǎn)數(shù)為139個(gè)，占總堿基數(shù)的11.6%。序列間相似性系數(shù)約在95%以上（表5），除了19號(hào)菌株與20號(hào)菌株序列完全一致以外，其他菌株序列均存在差異。

表3 20株斑玉蕈形態(tài)學(xué)特征Table 3 Morphology character of 20 Hypsizygus marmoreus

圖2 20個(gè)斑玉蕈菌株的IGS2擴(kuò)增電泳圖Fig.2 IGS2-PCR profile of 20 tested strains

表4 斑玉蕈菌株IGS2序列的登錄號(hào)Table 4 GenBank accession numbers of IGS2 sequences of 20 strains

表5 20個(gè)斑玉蕈菌株IGS2序列相似度Table 5 Table of similarity between sequence

2.3 RAPD分析

2.3.1 RAPD擴(kuò)增圖譜分析 從供試的100個(gè)隨機(jī)引物中篩選出條帶清晰穩(wěn)定、多態(tài)性高、重復(fù)性好的11個(gè)引物（表6）。11個(gè)引物共擴(kuò)增出142條清晰可用的DNA條帶，其中特異性條帶134條，多態(tài)性94.4%。不同引物擴(kuò)增出的DNA片段數(shù)不盡相同，在8～21條之間，其分子量絕大多數(shù)在0.5～4ku之間，不同菌株的DNA指紋圖譜均包含豐富的多態(tài)信息（圖3）。

表6 RAPD-PCR擴(kuò)增反應(yīng)的隨機(jī)引物Table 6 Primers of RAPD-PCR

圖3 部分引物對(duì)20個(gè)斑玉蕈菌株的擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 DNA fragments amplified by part random primers

2.3.2 RAPD聚類分析 根據(jù)所得圖譜資料，綜合11個(gè)引物對(duì)20個(gè)菌株的DNA擴(kuò)增結(jié)果，構(gòu)建遺傳距離矩陣。應(yīng)用NTSYSpc分析軟件計(jì)算菌株間的相似性系數(shù)，用UPGMA法進(jìn)行聚類分析，生成供試菌株的親緣關(guān)系樹狀圖（圖4）。

圖4 RAPD聚類分析圖Fig.4 Dendrogram of 20 strains based on RAPD cluster analysis

根據(jù)圖3顯示的結(jié)果，20個(gè)斑玉蕈菌株的相似系數(shù)主要在0.57～0.92之間。在大約0.68的相似性水平上，所有的菌株可以分為5個(gè)組，第一組以0.77水平值又分成A、B兩個(gè)亞組。A組共6個(gè)菌株，分別為1、2、4、7、10、11號(hào)菌株，B組共5個(gè)菌株，分別為3、6、8、15、16號(hào)菌株。13和17號(hào)菌株歸為第二組，9和1號(hào)菌株歸為第三組，14、18、19、20號(hào)菌株歸為第四組，其中白色突變菌株（19號(hào)）與原野生型菌株（20號(hào)）聚為一類，兩個(gè)白色野生型菌株（14號(hào)和18號(hào)）聚為一類。5號(hào)菌株與其他所有菌株分開，單獨(dú)列為一組。

3 結(jié)論與討論

本研究首先對(duì)20個(gè)供試菌株進(jìn)行了IGS2序列測(cè)序分析，雖然有研究報(bào)道IGS2序列為低保守基因區(qū)域，在種內(nèi)不同菌株間存在明顯差異。但本研究對(duì)斑玉蕈不同菌株的測(cè)序結(jié)果顯示，斑玉蕈的不同菌株間IGS2序列差異不明顯，僅存在個(gè)別堿基的差異，大部分菌株的IGS2序列相似度在95%以上，在IGS2片段的瓊脂糖凝膠電泳圖上也不能將不同菌株區(qū)分開來，這與香菇[2]、刺芹側(cè)耳[3]、雙色蠟?zāi)12]等食用菌IGS2序列的研究結(jié)果不一致。在其他部分真菌的IGS研究中，也觀察到與本研究類似的現(xiàn)象，即一個(gè)菌株的IGS2序列僅為單一條帶，不存在大小有顯著差異的多態(tài)性條帶。如梁宏等[13]對(duì)腥黑粉菌11個(gè)菌株的IGS2區(qū)域進(jìn)行了研究，研究結(jié)果表明各菌株的IGS2區(qū)域均為單一條帶，IGS2片段的保守性較強(qiáng)，沒有顯著的差異。在食用菌中，李黎等[14]在研究木耳不同菌株的IGS2序列時(shí)發(fā)現(xiàn)，木耳不同菌株的IGS2序列相似度很高，僅存在少數(shù)堿基的差異。因此，不同真菌的IGS2序列存在著明顯的差異，還有待進(jìn)一步的深入研究。

RAPD是一種能快速、簡(jiǎn)便且準(zhǔn)確地檢測(cè)基因組DNA多態(tài)性的分子標(biāo)記，本研究通過優(yōu)化RAPDPCR反應(yīng)體系，使用篩選出的11個(gè)引物擴(kuò)增出了142條DNA條帶，其中多態(tài)性條帶134條，多態(tài)性比例很高，說明RAPD技術(shù)可以用于斑玉蕈不同菌株親緣關(guān)系的鑒定。根據(jù)RAPD對(duì)供試菌株的擴(kuò)增結(jié)果，不同菌株間的擴(kuò)增圖譜有明顯的差異，因此所選引物可用于斑玉蕈不同菌株的快速鑒定，但由于RAPD技術(shù)仍存在不足之處，還需將其進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記才可以更加準(zhǔn)確地對(duì)菌株進(jìn)行鑒定[15]。

通過對(duì)遺傳距離及RAPD圖譜的分析，兩個(gè)白色野生型菌株單獨(dú)聚為一類，表明RAPD技術(shù)可以有效地將不同顏色的斑玉蕈菌株區(qū)分。5號(hào)菌株與其他所有菌株遺傳距離較遠(yuǎn)，單獨(dú)聚為一類，這與董巖等的研究結(jié)果一致[16]。推測(cè)其原因可能是5號(hào)菌株從國(guó)外引進(jìn)，與其他來源于國(guó)內(nèi)的斑玉蕈菌株的遺傳背景存在差異，且5號(hào)菌株的子實(shí)體形態(tài)與其他菌株也存在較大的差異（表2）。白色突變菌株（19號(hào)）與原褐色野生型菌株（20號(hào)）在RAPD圖譜中聚為一類，且相似系數(shù)為100%，在IGS2測(cè)序分析中，兩個(gè)菌株的序列相似度同樣為100%，這一結(jié)果表明19號(hào)菌株確實(shí)由20號(hào)菌株突變而來。

本研究表明，IGS2分析與RPAD技術(shù)相結(jié)合的方法準(zhǔn)確可靠，其中RAPD技術(shù)較IGS2分析具有更加豐富的多態(tài)性，能夠在DNA水平上鑒別不同菌株是否存在差異，為科學(xué)、準(zhǔn)確地判斷特定菌株的特異性奠定了基礎(chǔ)。

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