羊奶脂肪酶特性的研究

賈潤芳，張富新，楊吉妮，張 怡，李龍柱，晏慧莉，陳 雪，馬婷婷

（陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710062）

羊奶營養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、脂肪、乳糖、礦物質(zhì)以及多種維生素，其化學(xué)組成接近人奶[1]，被營養(yǎng)學(xué)界譽為“貴族奶”[2]。但羊奶具有膻味，限制了羊奶及其產(chǎn)品的消費。目前研究表明，羊奶膻味主要由奶中低級揮發(fā)性脂肪酸較高引起的，尤其是羊奶中的游離脂肪酸（FFA）[3-4]。奶中的FFA是在脂肪酶的作用下，催化乳脂肪降解形成的。乳中的脂肪酶主要來源于兩個方面，一方面源于乳中微生物污染，尤其是一些嗜冷菌分泌的脂肪酶[5]，這些脂肪酶通常具有一定的耐熱性，在63℃/30min的巴氏殺菌條件下仍能存活[6]，而這些微生物脂肪酶在實際生產(chǎn)中只要嚴(yán)格控制原料乳衛(wèi)生質(zhì)量是能夠得到控制的。乳中脂肪酶的另一個來源是乳中固有的脂肪酶，在剛分泌的乳中就存在，尤其在原料乳貯存過程中，對脂肪降解具有重要作用[7]，能夠引起乳脂肪的自發(fā)降解[8]。目前，人們發(fā)現(xiàn)乳中的固有脂肪酶主要來源于乳中的脂蛋白脂酶（Lipoprotein lipase，LPL）[7]，存在于乳清、酪蛋白和乳脂肪球表面，其分布比例在不同乳類中有一定差別[9]，羊奶中LPL主要分布在乳清和乳脂肪球中。國內(nèi)外大量研究都是在牛奶中進行[5-7，10-12]，對于羊奶中脂肪酶的特性沒有系統(tǒng)的報道，并且LPL對乳脂肪的分解程度與環(huán)境溫度、pH以及金屬離子密切相關(guān)[10]，因此本文對影響羊奶中脂肪酶活性的溫度、pH以及金屬離子進行研究，以便為提高羊奶產(chǎn)品質(zhì)量品質(zhì)，脫除羊奶膻味提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羊奶 來自陜西富省富平縣關(guān)中奶山羊合作社的20只關(guān)中奶山羊，采用手工擠奶，擠奶前用干凈毛巾對乳房清洗，為防止微生物污染，擠奶時棄去前3把奶（約20mL），然后用預(yù)先滅菌的取樣管收集奶樣，每只羊收集20mL乳樣，共收集20個奶樣，然后混合成混合樣，送到實驗室，在-40℃下冷凍備用，測定時在4℃冰浴中溶解；乙二胺四乙酸二鈉（Ethylene Diamine Tetra Acetic Sodium，EDTA）、巴比妥鈉（Barbitone sodium）、對硝基苯基丁酸酯（p-Nitrophenyl butyrate）、苯甲基磺酰氟（Phenyl-methane Sulphonyl Fluoride，PMSF）、乳品澄清劑（Clarifying Reagent for Dairy Products）、對硝基苯酚（p-nitrophenol） Sigma公司；二甲基磺酰胺（Dimethylformamide，DMF） 天津市天力化學(xué)試劑有限公司；乙腈 天津市富宇精細化工有限公司；以上試劑 均為分析純。

TU-1810型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；雷磁pHS-3C型精密pH酸度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司；XMTD數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司；移液槍（100-1000μL） 上海榮泰生化工程有限公司；CS1012型電熱鼓風(fēng)干燥箱 重慶實驗設(shè)備廠；玻璃儀器烘干器 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；KQ3200B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 脂肪酶活性的測定 采用Humbert[13]的方法測定。取0.5mL的奶樣與2mL巴比妥鈉（0.05mol/L pH7.6）緩沖液混合，37℃水浴保溫10min，加入50μL對硝基苯酚丁酸酯溶液，充分振蕩后，37℃水浴中保溫10min，添加400μL的混合抑制劑（0.06mol/L pH7.6的EDTA與苯甲基磺酰氟的體積比為3∶1），在37℃水浴保溫10min，加入2mL乳品澄清劑，振蕩使樣品澄清，在37℃水浴中保溫3～5min，在15min內(nèi)用紫外分光光度計，在412nm下測定吸光度。然后用對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線計算脂肪酶活性。

脂肪酶活性定義為，1mL乳樣在1min內(nèi)生成1μmol對硝基苯酚所需要的酶量為1個活性單位（U）。計算公式為：

脂肪酶活性（U）=A/（B·T）

式中：A表示體系中產(chǎn)生的對硝基苯酚的量（μmol）；B表示乳樣體積（mL）；T表示酶作用的時間（min）。

脂肪酶相對活性按下式計算：

相對酶活（%）=測定酶活性/最大酶活性×100

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 甲液的配制：精確稱取0.139g對硝基苯酚，加入2mL巴比妥鈉（0.05mol/L pH7.6）緩沖溶液、400μL混合抑制劑（0.06mol/L pH7.6的EDTA與苯甲基磺酰氟的體積比為3∶1）和2mL的乳品澄清劑，用乙腈定容至100mL，得到10mmol/L的對硝基苯酚溶液。乙液的配制：用吸管吸取2mL巴比妥鈉緩沖溶液、400μL混合抑制劑和2mL乳品澄清劑于100mL的容量瓶中，用乙腈定容至100mL，得到乙液稀釋液。將甲液用乙液稀釋液進行稀釋，得到不同濃度（0、10、20、30、40、50、60、70μmol/L）的對硝基苯酚溶液，412nm處測吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 脂肪酶最適溫度的測定 將1.2.1實驗方法中的溫度分別保持在25、30、35、37、40、45、50、55、60、65、70℃，并將pH調(diào)節(jié)到6.5，然后測定脂肪酶的活性。

1.2.4 脂肪酶熱穩(wěn)定性的測定 在pH為6.5的條件下，將乳樣分別在40、50、60、70、80、90℃水浴中保溫10、30、60、90、120、180min后，然后測定其脂肪酶活性。

1.2.5 脂肪酶最適pH的測定 在25℃的條件下，用0.1mol/L的HCl或0.1mol/L的NaOH將乳樣的pH調(diào)整到4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，然后測定其脂肪酶的活性。

1.2.6 脂肪酶pH穩(wěn)定性的測定 用0.1mol/L HCl或0.1mol/L NaOH將乳樣pH調(diào)整到5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，然后在25℃下放置30、60、90min，測定脂肪酶的活性。

1.2.7 金屬離子對脂肪酶活性影響的測定 在乳樣中分別加入濃度為100mmol/L的CaCl2、ZnSO4、NaCl、Al2（SO4）4、FeSO4、Fe3（SO4）2、CuSO4、K2SO4、MnSO4、MgSO4，使其在羊奶中金屬離子的濃度分別達到5mmol/L和10mmol/L，在25℃下放置30min后，測定其脂肪酶的活性。

1.3 數(shù)據(jù)的處理

數(shù)據(jù)采用Excel、DPS軟件進行差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1 對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of p-nitrophenol

由圖1可見，對硝基苯酚濃度與吸光度值呈線性關(guān)系，回歸方程為y=0.02x+0.0131，R2=0.9996。式中，x表示對硝基苯酚濃度，y表示412nm處的吸光度值，0.9996為標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)。由此可知，測定對硝基苯酚濃度在0～70μmol/L范圍內(nèi)，具有良好的線性關(guān)系。

2.2 脂肪酶的最適溫度

圖2 溫度對羊奶中脂肪酶活性的影響Fig.2 Effect of temperature on lipase activity in goat milk

從圖2可以看出，在25～37℃之間，羊奶中脂肪酶活性隨溫度升高逐漸提高（p＜0.05）；在37℃時，脂肪酶活性達到最高；當(dāng)溫度大于37℃時，隨著溫度的升高脂肪酶活性顯著性降低（p＜0.05），溫度達到70℃時，脂肪酶活性僅為0.23U。酶促反應(yīng)與溫度密切相關(guān)，酶活性達到最高時的溫度稱為酶的最適溫度。酶是一種活性蛋白質(zhì)，當(dāng)溫度過高時，酶蛋白遇熱變性，活性降低，甚至失活。Jandal[10]和Harper[14]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)熱處理強度較大時，脂肪酶活性降低；Jandal[15]報道乳中的脂肪酶最適溫度為37℃，這與本研究中脂肪酶最適溫度一致。

2.3 脂肪酶的熱穩(wěn)定性

圖3 脂肪酶的熱穩(wěn)定性Fig.3 Heat stability of lipase in goat milk

從圖3可以看出，在40℃保溫過程中，羊奶中脂肪酶活性無明顯變化（p＞0.05）；在50℃保溫180min時，脂肪酶活性略有下降（p＞0.05），仍保持較高的活性；但當(dāng)熱處理溫度大于60℃時，脂肪酶活性顯著（p＜0.05）下降，在60℃保溫60min時，羊乳中脂肪酶活性迅速降低，殘余活性僅為處理前的40%。在70℃以上處理90min時，脂肪酶活性幾乎喪失。由此可見，羊乳中的脂肪酶在熱處理溫度低于50℃時具有較好的熱穩(wěn)定性，隨著熱處理溫度的升高，脂肪酶熱穩(wěn)定性降低。乳中脂肪酶活性不僅與熱處理溫度有關(guān)，同時與熱處理時間密切相關(guān)，Law[16]研究表明，乳在63℃下處理30min時，脂肪酶仍然有55%～100%的活性，在65℃下20min時脂肪酶完全失活[17]，由此可見，熱處理溫度是影響羊乳中脂肪酶活性的主要因素。

2.4 脂肪酶的最適pH

圖4 pH對脂肪酶活性的影響Fig.4 Effect of pH on the lipase in goat milk

由圖4可以看出，當(dāng)羊乳pH小于6.5時，隨著pH的增大，脂肪酶活性逐漸增高（p＜0.05）；當(dāng)pH大于6.5時，隨著pH的增大，脂肪酶活性逐漸降低（p＜0.05）；當(dāng)pH為6.5時，羊奶脂肪酶活性最高。由此可見，羊乳中脂肪酶的適宜pH在6.0～7.0之間，其最適pH為6.5。Hess[18]研究認(rèn)為乳中脂肪酶最適pH為6.5，與本研究中羊奶脂肪酶最適pH一致。

2.5 脂肪酶的pH穩(wěn)定性

圖5 脂肪酶的pH穩(wěn)定性Fig.5 pH stability of lipase in goat milk

從圖5可以看出，隨著處理時間的延長，除pH5中的60min比30min活性略高以外，羊奶中脂肪酶活性均呈下降的趨勢（p＞0.1），但在不同pH下處理相同時間時，脂肪酶活性下降程度有所差異。在pH5.0～6.5處理時，脂肪酶活性下降程度較小，在pH5.0時，處理60min時，脂肪酶活性僅降低20%；在pH6.5時處理60min時，脂肪酶活性下降17%；然而在pH7.0時，處理60min，脂肪酶活性下降60%。由此可見，羊奶脂肪酶在pH5.0～6.5范圍內(nèi)具有較高穩(wěn)定性。Dharmsthiti[19]報道乳中脂肪酶在pH6.0～8.0較穩(wěn)定，與本研究中羊奶中脂肪酶pH穩(wěn)定性基本一致。pH可引起酶蛋白質(zhì)電荷的變化，從而影響酶穩(wěn)定性，在一定pH范圍內(nèi)，酶蛋白帶有一定的電荷，表現(xiàn)出較高的活性。同時pH過高或過低都會影響酶構(gòu)象的變化，從而影響酶與底物的結(jié)合能力[20]。

2.6 金屬離子對脂肪酶活性的影響

表1 金屬離子對于脂肪酶相對活性的影響（%）Table 1 Effect of metal ion on the relative activity of lipase in goat milk（%）

由表1可以看出，不同金屬離子對羊奶中脂肪酶活性具有不同的影響。在羊奶中添加Ca2+、Fe2+可明顯提高乳中脂肪酶的活性；添加K+、Zn2+、Cu2+、Mn2+和Mg2+可使乳中脂肪酶的活性降低；而在羊乳中添加Na+時，羊奶中的脂肪酶活性幾乎無明顯變化。表明Ca2+、Fe2+對羊奶中脂肪酶具有激活作用，而K+、Zn2+、Cu2+、Mn2+和Mg2+對脂肪酶具有抑制作用。同時發(fā)現(xiàn)在羊乳中添加5mmol/L的Al3+和Fe3+時脂肪酶活性降低，而添加10mmol/L的Al3+和Fe3+時脂肪酶的活性升高，表明低濃度的Al3+和Fe3+對脂肪酶活性具有抑制作用，而高濃度的Al3+和Fe3+對脂肪酶具有激活作用。金屬離子對脂肪酶活性的影響可能與金屬離子參與酶的輔基有關(guān)[21]。Rathi[22]研究表明，Ca2+可激活脂肪酶；Hess[18]和Metin[23]的研究也證明了，Zn2+、Cu2+對脂肪酶有抑制作用；Tao[24]的研究認(rèn)為，Mn2+對脂肪酶有一定的激活作用。不同金屬離子對酶的結(jié)構(gòu)和功能所起的作用不相同。金屬離子可能是通過結(jié)合于酶活性部位影響酶的構(gòu)象與活力[25-26]。對于金屬離子濃度，在低濃度時，金屬離子通過非特異性的靜電相互作用，而在較高的濃度，金屬離子可影響脂肪酶結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的特異效應(yīng)，并且高濃度金屬離子通常對酶的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性產(chǎn)生不利的影響[27]。

3 結(jié)論

通過對影響羊奶脂肪酶活性的溫度、pH和金屬離子的研究表明，羊奶中脂肪酶在37℃時具有較高活性，且在40～50℃時具有較高的熱穩(wěn)定性，在溫度大于70℃時，脂肪酶活性損失較大；羊奶脂肪酶受pH影響較大，在pH6.5時具有較高活性，且在pH5.0～6.5時穩(wěn)定性較高；不同金屬離子對羊奶脂肪酶也有一定的影響，Ca2+和Fe2+對羊奶中脂肪酶具有激活作用，而K+、Zn2+、Cu2+、Mn2+和Mg2+對脂肪酶具有抑制作用，低濃度的Al3+和Fe3+對脂肪酶活性具有抑制作用，而高濃度的Al3+和Fe3+對脂肪酶具有激活作用。

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