響應(yīng)面法優(yōu)化馬血中凝血酶原激活條件的研究

米麗班·霍加艾合買提，毛居代·亞爾買買提，熱孜耶·喀日，熱合滿·艾拉，*

（1.新疆師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院科研處，新疆烏魯木齊830054；2.新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊830054；3.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊830052）

凝血酶（thrombin，EC3.4.21.5）是在血液凝固系統(tǒng)中起重要作用的絲氨酸蛋白水解酶，它是凝血酶原經(jīng)凝血酶原激活物激活而成，具有較高的專一性，是近年來國內(nèi)開發(fā)的一種新型速效局部止血藥，臨床上廣泛應(yīng)用于消化道出血和外科手術(shù)止血[1]。1939年從血清中分離凝血酶成功，用于肝臟實質(zhì)性出血和骨髓出血止血取得顯著效果。自上世紀(jì)80年代末，國內(nèi)廠家相繼開發(fā)成功，并廣泛應(yīng)用于臨床各科[2]。制備凝血酶的原料多為牛（豬和人的血漿）。另外，還有從鴕鳥[3]和鮭魚[4]的血液分離凝血酶的報道。我國是一個傳統(tǒng)養(yǎng)馬大國，有15個地方品種和11個培育品種，約占世界馬品種的十分之一，存欄馬匹達到790萬匹，居世界之首[5]。凝血酶原本身沒有活性，不能將纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白。只有將其激活成凝血酶才有應(yīng)用的價值。因此，這是凝血酶制備的關(guān)鍵一步[6]。生理條件下，凝血酶由凝血酶原在凝血因子Xa、凝血因子V、Ca+2和磷脂作用下激活生成。在缺乏某些激活因子的情況下，也能將凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶，但是轉(zhuǎn)化率很低[7]。本研究從食品安全的角度考慮，以響應(yīng)面方法優(yōu)化馬血凝血酶原的激活工藝，考察激活條件對凝血酶比活力的影響，以其對動物血資源的綜合開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬血 新疆華凌畜牧產(chǎn)業(yè)開發(fā)有限公司屠宰場或者華菱屠宰場；檸檬酸三鈉、氯化鈉、纖維蛋白原、凝血酶標(biāo)準(zhǔn)品、氯化鈣、考馬斯亮藍G-250、牛血清蛋白、乙醇 皆為分析純。

HH-54型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠；TD5A＿WS型臺式低速離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；TU-1810型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；PL203型電子天平 梅特勒托利儀器有限公司；DZKW-D-2型電熱恒溫水浴鍋 北京市光明醫(yī)療儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 馬血漿的制備 取新鮮馬血與3.8%檸檬酸三鈉體積比為1∶7的溶液，攪拌均勻，以3000r/min的速度離心15min，除去紅細胞，收集血漿，在-15℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 凝血酶原的制備 準(zhǔn)確取50mL在4℃解凍的血漿置于燒杯中，以9倍體積的冷去離子水稀釋，充分混勻，靜置30min后，用1%醋酸調(diào)pH至5.1，5℃靜置6h后，以3000r/min的速度離心15min，虹吸上清液，沉淀混合液溶于含0.9%NaCl、0.075%草酸鉀溶液，攪拌溶解1h，3000r/min離心10min收集上清液，將此液過截留分子量為5ku的超濾膜，收集膜上部分。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 激活時間對凝血酶比活力的影響 準(zhǔn)確取5mL凝血酶原濃縮液液置于試管中，加入最終濃度為0.1mol/L CaCl2溶液，在30℃條件下，分別選取不同的激活時間：0.5、1.5、2.5、3.5、4.5h，測蛋白質(zhì)的濃度和酶的活力。

1.2.3.2 激活溫度對凝血酶比活力的影響 準(zhǔn)確取5mL凝血酶原濃縮液液置于試管中，加入最終濃度為0.1mol/L CaCl2溶液，分別在10、20、30、40、50℃條件下激活2.5h，測蛋白質(zhì)的濃度和酶的活力。

1.2.3.3 Ca2+濃度對凝血酶比活力的影響 準(zhǔn)確取5mL凝血酶原濃縮液液置于試管中，分別加入最終濃度為0.07、0.10、0.13、0.16mol/L CaCl2溶液，在30℃條件下激活2.5h，測蛋白質(zhì)的濃度和酶的活力。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化提取條件 為了優(yōu)化凝血酶原激活工藝條件，以凝血酶比活力為響應(yīng)值，選取激活時間、激活溫度、Ca2+濃度做單因素實驗；在單因素實驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計原理，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法進行實驗設(shè)計，確定馬血中凝血酶原激活的最佳工藝條件，實驗因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面實驗設(shè)計Table 1 Factors and levels of response surface analysis

1.2.5 蛋白質(zhì)含量測定 考馬斯亮藍G-250法測定蛋白質(zhì)含量[8]。

1.2.6 凝血酶活力測定 參照鐘峻等[9]的方法。準(zhǔn)確取纖維蛋白原0.125g，加入100mL 0.9%NaCl溶液（pH7.17），配制成纖維蛋白原溶液，并置于10支離心管內(nèi)，4℃下保存?zhèn)溆谩Ｈ∧笜?biāo)準(zhǔn)品，用0.9%NaCl溶液分別制成每1mL中含5.0、6.4、8.0、10U的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。另取試管4支，各精密加入纖維蛋白原溶液0.9mL，置37℃水浴中保溫5min，再分別精密量取上述4種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液各0.1mL，迅速加入上述各試管中，搖勻，立即計時，置37℃水浴中，觀察纖維蛋白的初凝時間，每種濃度測5次，求平均值。在雙對數(shù)坐標(biāo)紙上以標(biāo)準(zhǔn)品效價（單位）為橫坐標(biāo)，凝結(jié)時間（秒）為縱坐標(biāo)，計算回歸方程。凝血酶比活力計算公式如下：

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 利用統(tǒng)計分析Design-Expert軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 凝血酶的標(biāo)準(zhǔn)曲線

利用凝血酶催化纖維蛋白原凝固的原理測定其活性。酶活性單位定義：每分鐘催化轉(zhuǎn)變反應(yīng)體系中的1μmol底物的酶量為一個國際單位（U）。

圖1 凝血酶標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of thrombin

2.2 單因素實驗

2.2.1 激活時間對凝血酶比活力的影響 由圖2可知，隨著激活時間的延長，凝血酶比活力先增大后減小，這可能與環(huán)境有關(guān)系，說明馬凝血酶是不太穩(wěn)定的，激活時間為2.5h時比活力達到最高值，激活時間超過2.5h酶活損失較多，因此激活時間選擇2.5h。

圖2 激活時間對凝血酶比活力的影響Fig.2 Effect of activating time on specific activity of thrombin

2.2.2 激活溫度對凝血酶比活力的影響 由圖3激活溫度對凝血酶比活力的影響可知，隨著激活溫度的升高，凝血酶比活力緩慢增加，當(dāng)激活溫度為30℃時，凝血酶比活力達到最高值，繼續(xù)增大激活溫度，酶活力降低，這可能是因為馬血凝血酶不耐熱，在較高的溫度導(dǎo)致其失活。因此實驗中選擇溫度為30℃。

圖3 激活溫度對凝血酶比活力的影響Fig.3 Effect of activating temperature on specific activity of thrombin

圖4 Ca2+濃度對凝血酶比活力的影響Fig.4 Effect of Ca2+concentration on specific activity of thrombin

2.2.3 Ca2+濃度對凝血酶比活力的影響 由圖4可知，隨著Ca2+濃度的增加，凝血酶比活力逐漸增加，當(dāng)最終濃度超過0.10mol/L時，凝血酶比活力趨于下降，這說明Ca2+濃度超過一定范圍時，同樣會導(dǎo)致提取液中凝血酶的變性失活，并且加入過多的Ca2+對后續(xù)的處理造成很大的麻煩，綜合考慮選擇Ca2+濃度為0.1mol/L。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化實驗

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計原理，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法進行實驗設(shè)計，所得結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計方案與實驗結(jié)果Table 2 Design and results of response surface analysis

2.4 數(shù)學(xué)模型的建立

根據(jù)表2所得的實驗數(shù)據(jù)，采用響應(yīng)面統(tǒng)計方法對實驗數(shù)據(jù)擬合，建立凝血酶比活力與激活時間、激活溫度、Ca2+濃度三因子的二次多項數(shù)學(xué)回歸方程：

Y=51.48+0.83×A+0.62×B+1.86×C+0.032×A×B-0.018×A×C-0.11×B×C-2.06×A2-1.33×B2-4.13×C2

回歸模型方差分析見表3，模型的p=0.0002＜0.01，說明對馬血凝血酶建立的回歸模型是極顯著的，失擬項p=0.9937＞0.05不顯著，相關(guān)系數(shù)R2=0.9683，表示模型的擬合度良好，實驗誤差較小?？梢赃x用此模型對凝血酶原的激活工藝進行分析和預(yù)測。同時，對所考察因素的顯著性排序為：C＞A＞B。雖然交互項的顯著性并不明顯，但它們二次項具有顯著性，可以確定此模型是合適的。激活時間，激活溫度對凝血酶比活力的影響顯著（p＜0.05），Ca2+濃度對凝血酶比活力的影響極顯著（p＜0.01）。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance in regression model

2.5 響應(yīng)面分析與優(yōu)化

圖5為0.1mol/L Ca2+時，激活時間與激活溫度的交互作用對凝血酶比活力的影響曲面。由圖5可知激活時間1.5～3.5h時，凝血酶比活力先增大后減少，2.81h時達到最大值；激活溫度20～40℃時，凝血酶比活力也先增大后減少，溫度在32.35℃時達到最大值。

圖5 Y=（A，B）以凝血酶比活力為響應(yīng)值的等高線及響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plot and contour map plot in reponse to thrombin for Y=（A，B）

圖6為激活溫度在30℃時，激活時間與Ca2+濃度的交互作用對凝血酶比活力的影響曲面。由圖6可知激活時間1.5～3.5h時，凝血酶比活力先增大后減少，2.81h時達到最大值；Ca2+濃度在0.07～0.13mol/L時，凝血酶比活力先增大后減少，Ca2+濃度為0.11mol/L時達到最大值。

圖6 Y=（A，C）以凝血酶比活力為響應(yīng)值的等高線及響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plot and contour map plot in reponse to thrombin for Y=（A，C）

圖7為激活時間為2.5h時，激活溫度與Ca2+濃度的交互作用對凝血酶比活力的影響曲面。由圖7可知激活溫度20～40℃時，凝血酶比活力先增大后減少，溫度在32.35℃時達到最大值；Ca2+濃度在0.07～0.13mol/L時，凝血酶比活力先增大后減少，Ca2+濃度為0.11mol/L時達到最大值。

圖5～圖7是以凝血酶比活力為響應(yīng)值響應(yīng)曲面圖，通過對相應(yīng)的等高線及響應(yīng)曲面分析，由Design-Expert軟件給出響應(yīng)圖的預(yù)測值，凝血酶比活力為50.5274U/mg，其對應(yīng)的工藝參數(shù)是：激活時間2.81h、激活溫度32.35℃、Ca2+濃度為0.11mol/L。校正理論水平分別為激活時間2.8h、溫度32℃、Ca2+濃度0.11mol/L，在此條件下做3組平行實驗，以檢驗?zāi)Ｐ偷臏?zhǔn)確性。所得的凝血酶比活力分別為51.63、52.05、49.81U/mg，平均值為51.16U/mg。驗證值和預(yù)測值非常接近，說明回歸方程可以較真實的反映各篩選因素的影響，建立的模型與實際情況比較吻合，再次證明該回歸模型的可行性。

圖7 Y=（B，C）以凝血酶比活力為響應(yīng)值的等高線及響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface plot and contour map plot in reponse to thrombin for Y=（B，C）

3 結(jié)論

馬血凝血酶原激活條件，利用實驗設(shè)計軟件Design-Expert，通過響應(yīng)面分析法建立馬血凝血酶原激活工藝的數(shù)學(xué)回歸模型，并對各因子對凝血酶比活力的影響進行了分析，得出影響馬血凝血酶原激活的各因素順序依次為：Ca2+濃度＞激活時間＞激活溫度；馬血凝血酶原激活工藝的最佳參數(shù)為：激活時間2.8h、激活溫度32℃、Ca2+濃度0.11mol/L，凝血酶比活力為51.16U/mg。

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