100μL移液器國際比對不確定度的分析與評定*

佟 林 王金濤 劉子勇 郭立功 暴雪松 趙曉惠

(中國計量科學(xué)研究院，北京 100013)

0 引言

移液器是具有一定量程范圍，可將液體從容器內(nèi)吸出，移入另一容器內(nèi)的計量器具，作為量出式量器，分為定量和可調(diào)兩種，廣泛用于醫(yī)院、輸血站、生化實驗室、環(huán)境實驗室、制藥實驗室、食品等分析實驗室的精密微量取樣，可以對少量液體樣品及試液進行迅速、準確的定量取樣和加樣。

隨著醫(yī)療衛(wèi)生、生物、制藥、能源等領(lǐng)域的發(fā)展，微量移液器作為近幾年的新產(chǎn)品，其加樣更為精確，有利于提高實驗的準確性與重復(fù)性，解決了大量分析試驗中快速、準確微量取樣的難題，替代了過去的玻璃吸管，在上述領(lǐng)域取得了廣泛應(yīng)用。據(jù)Global Industry Analysts發(fā)布的最新數(shù)據(jù)，亞太地區(qū)微量移液裝置的增長率為5.7%，預(yù)計到2012年全球微量移液裝置的市場將達到9.962億美元，同時全球?qū)σ埔浩鞯谋Ｓ辛恳苍诳焖僭鲩L，這就要求世界各國對微量移液器的檢定及校準能力要與國際接軌。

1 比對情況介紹

國際計量局(BIPM)流量計量工作組(WGFF)第10次年會于2010年10月在臺灣舉行。會議上，與會代表一致同意進行一次微小量的國際間比對。本次關(guān)鍵比對的目的在于，通過比對來檢驗各參比實驗室對100μL移液器進行校準以及校準結(jié)果的一致性，及不同的測量設(shè)備和校準方法所帶來的不確定度。

葡萄牙質(zhì)量學(xué)會(IPQ)下屬的容量實驗室作為主導(dǎo)實驗室，負責(zé)比對方案的確定、傳遞標(biāo)準的選取、以及后續(xù)的數(shù)據(jù)分析等工作。中國計量科學(xué)研究院(NIM)以及墨西哥國家計量中心(CENAM)被選為副主導(dǎo)實驗室，協(xié)助主導(dǎo)實驗室進行比對安排，以及比對數(shù)據(jù)的整理及傳遞標(biāo)準值的確定等相關(guān)工作。

參加本次國際關(guān)鍵比對的國家有：葡萄牙、南非、中國、墨西哥、巴西、英國、土耳其、法國、肯尼亞，比對過程中英國計量院退出，各參比實驗室均采用靜力稱重法對移液器進行校準，比對采用環(huán)式路線進行，本次比對于2011年7月開始，并于2012年7月結(jié)束。

本次比對選用的傳遞標(biāo)準是單頭型定量移液器，如圖1所示，共配備5支，編號分別為：354828Z、354853Z、354864Z、354868Z、354872Z。

圖1 傳遞標(biāo)準

2 用于微量容積值計算的數(shù)學(xué)模型

微量移液器是一種量出式計量器具，其校準方法主要有靜力稱重法、光度吸收法和滴定法等方法，其中一般以靜力稱重法的準確度最高。由于此次國際比對的量值為100μL，在這個量程靜力稱重法的優(yōu)勢比較明顯，所以本次國際比對采用靜力稱重法進行微量液體容積值的測量,并換算成標(biāo)準溫度20℃下容積值，其數(shù)學(xué)模型為：

×[1-γ(t-20)]

(1)

式中：V20為修正到20℃下的容積值，μL；II為帶液過渡容器質(zhì)量值，mg；IE為過渡容器空稱質(zhì)量值，mg；ρW為實驗溫度下的水密度值，通過Tanaka公式計算[2]，mg/μL；ρA為空氣密度，mg/μL；ρB為砝碼密度，mg/μL；γ為移液器的熱膨脹系數(shù),2.4×10-4℃-1；t為實驗過程中水溫度，℃。

由于微量移液器作為活塞式量器，是通過活塞的移動產(chǎn)生負壓和正壓進行吸液及放液。即使活塞容積不發(fā)生變化，活塞內(nèi)大氣壓強的變化也會導(dǎo)致在相同溫度條件下移液器吸液量和排液量的不一致。這是由于微量移液器內(nèi)部與外部氣壓不同從而產(chǎn)生壓強差，而壓強差又導(dǎo)致殘留量和移液器虹吸現(xiàn)象的出現(xiàn)。通過修正后可以計算出液體的變化量。修正后的微量容積值計算模型為：

(2)

式中：Vt為活塞室容積，μL；g為重力加速度，m/s2；hw為吸液嘴中升高的液柱，m；pL,X1為X1中大氣壓強，Pa；pL,X2為X2中大氣壓強，Pa；ρw為X2中水密度，kg/m3。

3 不確定度評定

在測量過程中有許多影響因素成為了不確定度源，例如人為操作因素、儀器本身的不確定度、水的密度以及空氣密度和大氣壓力等等，現(xiàn)以354828Z移液器為例，進行不確定度的分析。

3.1 標(biāo)準不確定度的A類評定

按比對技術(shù)要求，對354828Z移液器，在同一條件下進行了10次獨立的重復(fù)測量，得出其在標(biāo)準溫度20℃下的容積值，詳見表1。

表1354828Z測量結(jié)果統(tǒng)計表

由貝塞爾公式求得測量值的實驗標(biāo)準差：

由測量重復(fù)性導(dǎo)致的測量結(jié)果的A類標(biāo)準不確定度為：

3.2 標(biāo)準不確定度的B類評定

3.2.1 水質(zhì)量測量引入的不確定度分量u(M)

移液器排出的水質(zhì)量是通過電子天平稱量獲得的，因此水質(zhì)量測量B類不確定度取決于天平和砝碼的測量誤差，其中天平測量不確定度影響因素為靈敏度、分辨率和偏載，分別為us、ud和uE，砝碼測量不確定度為uW，計算公式如下所示：

式中：us為電子天平的靈敏度,mg；ud為電子天平的分辨力,mg；uE為電子天平的偏載,mg。

=5.77×10-3mg

3.2.2 砝碼密度引入的不確定度分量u(ρB)

砝碼密度的測量誤差為0.14g/cm3，(k=2)，所以：

u(ρB)=0.14/2=7.0×10-2g/cm3

3.2.3 空氣密度引入的不確定度分量u(ρA)

按照CIPM推薦使用的空氣密度計算公式，分析計算可以得到空氣密度的測量的標(biāo)準不確定度為：

u(ρA)=6.7×10-7g/cm3

3.2.4 水密度引入的不確定度分量u(ρW)

測量介質(zhì)為去離子水，所以水密度采用了國際實用溫標(biāo)水密度值，其允差為±1×10-4g/cm3，服從均勻分布條件，其測量標(biāo)準不確定度為：

3.2.5 移液器體脹系數(shù)引入的不確定度分量u(β)

移液器的熱膨脹系數(shù)為2.4×10-4℃-1，根據(jù)經(jīng)驗值取u(β)=1.0×10-6℃-1。

3.2.6 水溫度測量引入的不確定度分量u(t)

水溫度測量誤差為±0.01℃，考慮到水溫梯度的影響，服從均勻分布條件，其測量標(biāo)準不確定度為：

3.2.7 稱量過程中水蒸發(fā)量引入的不確定度分量

移液器校準過程中，所排放水在稱量時蒸發(fā)量按經(jīng)驗值取1.15×10-2μL。

通過對式(1)進行偏微分求導(dǎo)之后，得到B類不確定度分量：

=1.42×10-2μL

3.3 合成標(biāo)準不確定度

上述不確定度評定方法僅僅適用于傳遞標(biāo)準非常穩(wěn)定的條件下，即傳遞標(biāo)準本身的不確定度可以忽略。但是在測量中發(fā)現(xiàn)移液器(特別是微量移液器)受結(jié)構(gòu)的影響性能不是足夠的穩(wěn)定，所以需要將傳遞標(biāo)準不穩(wěn)定性所引入的不確定度分量考慮在內(nèi)。比對過程中，主導(dǎo)實驗室在不同時間對作為傳遞標(biāo)準的移液器進行了3次測量，以此來檢驗其在傳遞過程中的穩(wěn)定性，同時也對移液器校準過程中操作方法[7](如移液器吸液嘴侵沒深度、侵沒角度、放液速度、放液角度等)進行了實驗性研究，通過研究發(fā)現(xiàn)移液器自身結(jié)構(gòu)所造成的最大允許誤差能夠達到±0.4%(Eexp)，因此需按式(3)計算新增的不確定度分量：

(3)

式中：s為主導(dǎo)實驗室標(biāo)準不確定度；n為主導(dǎo)實驗室對同一支移液器校準次數(shù)，取n=3；Eexp為移液器最大允許誤差，按經(jīng)驗值取Eexp=0.4%。

通過式(3)計算得出ust為0.13μL

所以，經(jīng)過修正之后的合成標(biāo)準不確定度計算方法為：

354828Z號移液器測量結(jié)果的不確定度分量匯總表如表2。

3.4 擴展不確定度

取k=2，則擴展不確定度：

4 比對結(jié)果分析

本次比對選用各參比實驗室測量結(jié)果的加權(quán)平均值作為參考值，按式(4)計算。

(4)

此時加權(quán)算術(shù)平均值的標(biāo)準不確定度按式(5)計算。

表2不確定度分量匯總表

(5)

通過計算得出參考值Y=100.03μL，加權(quán)算術(shù)平均值的標(biāo)準不確定度uri=0.10μL。

比對結(jié)果采用比對判據(jù)En值進行評價，En值又稱為歸一化偏差，為各實驗室比對結(jié)果與參考值的差值與該差值不確定度之比，其評判原則是：|En|≤1參比實驗室測量結(jié)果與參考值之差在合理的預(yù)期范圍之內(nèi)，比對結(jié)果可以接受。

(6)

因各參比實驗室測量結(jié)果相互無關(guān)，因此ui按式(7)計算：

(7)

通過以上公式可以得出NIM所提交的測量結(jié)果的En值為0.85，因此按評判原則，本次比對所提交的測量結(jié)果為有效比對值，如圖2所示，同時也可以證明本次比對NIM所提交的校準數(shù)據(jù)是準確有效的。

圖2 比對結(jié)果匯總圖

經(jīng)過以上分析及計算之后，各參比實驗室校準數(shù)據(jù)及擴展不確定度詳見表3。

表3測量結(jié)果及不確定度匯總表

5 結(jié)束語

通過比對發(fā)現(xiàn)大氣壓力對移液器的校準結(jié)果有著較大影響，經(jīng)過修正后各參比實驗室的校準結(jié)果有了較好的一致性；同時經(jīng)過對移液器的分析和數(shù)學(xué)模型的研究得出，由于其自身結(jié)構(gòu)存在不穩(wěn)定性所帶入的不確定度分量是不確定度分析中的一個主要來源。本次比對證明用于微量容積值計算及不確定度分析的數(shù)學(xué)模型其算法準確、結(jié)果可靠，很好地解決了移液器在日常檢定及校準中的數(shù)據(jù)處理問題。

[1] 劉子勇. 容量計量[M]. 北京:中國計量出版社，2009

[2] Tanaka, M., et. Al.Recommended table for the density of water between 0 ℃ and 40℃ based on recent experime ntal reports.Metrologia, 2001, 38：301-309

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