紅茶菌發(fā)酵液抑菌活性的研究

申瑞瑞, 李亞柯, 王伯華

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紅茶菌發(fā)酵液抑菌活性的研究

申瑞瑞1, 李亞柯1, 王伯華*2

(1. 湖南文理學(xué)院 芙蓉學(xué)院, 湖南 常德, 415000; 2. 湖南文理學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，湖南 常德，415000)

紅茶菌發(fā)酵液是由茶糖水發(fā)酵制成的茶飲料, 紅茶菌膜為細菌、酵母和真菌組成的共生菌. 紅茶菌發(fā)酵液成分比較復(fù)雜, 采用紙片法和牛津杯法測試了K-A紅茶菌發(fā)酵液對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的抑菌效果, 結(jié)果顯示它對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑制作用. 抑菌活性主要由有機酸和某種對熱敏感的物質(zhì)提供. 研究還發(fā)現(xiàn)不同來源的K-A紅茶菌和K-H紅茶菌發(fā)酵特征差異顯著.

紅茶菌; 發(fā)酵液; 抑菌活性

紅茶菌(Kombucha)是一種由酵母菌、醋酸菌和乳酸菌組成的共生菌, 用它發(fā)酵茶糖水可以制成略帶甜酸風(fēng)味的茶飲料[1], 其是我國一種歷史悠久的民間傳統(tǒng)飲料. 近年來, 對紅茶菌保健功能的研究發(fā)現(xiàn)它具有增強機體免疫力、促進消化等功能[2—3]. 近年來, 科研人員都將其作為天然產(chǎn)物的資源庫加以開發(fā)利用[4].

本研究以K-A紅茶菌為研究對象, 測試其發(fā)酵液對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果, 并初步分析抑菌物質(zhì)的耐熱性. 同時比較了不同來源的K-A紅茶菌和K-H紅茶菌的發(fā)酵特征, 以期為紅茶菌發(fā)酵液中抑菌活性物質(zhì)的開發(fā)利用提供理論依據(jù).

1 材料

1.1 菌種

紅茶菌K-A購自安徽省; 紅茶菌K-H購自黑龍江省; 供試菌株大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌均由湖南文理學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院微生物實驗室從腐敗的食品中分離獲取并保藏.

1.2 菌種培養(yǎng)

紅茶菌的培養(yǎng)[5]: 在沸水中加入0.5%的紅茶, 浸泡10 min后濾渣, 加入10%的蔗糖, 121 ℃滅菌15 min即得茶糖水, 冷卻后接入一小塊紅茶菌菌膜, 30 ℃培養(yǎng)7～10 d.

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的培養(yǎng): 均采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、氯化鈉0.5%、瓊脂2%), 37℃培養(yǎng)3～5 d.

1.3 主要儀器

pH測定儀(pH3110)、超凈工作臺(SW-CJ-IF*)、低速離心機(TDL-40B*)、手提式壓力蒸汽滅菌器(YX280B*)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-52C)、電熱恒溫干燥箱(DHG-9140)、電熱恒溫水浴鍋(HH-S4).

2 方法

2.1 供試菌菌懸液的制備

從大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的斜面培養(yǎng)基上用接種環(huán)適量挑取幾環(huán)菌體, 加到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中, 置于37 ℃培養(yǎng)箱180 rpm振蕩培養(yǎng)24 h, 將菌懸液的OD480 nm調(diào)整至0.5～0.6后備用[6].

2.2 抑菌試驗

2.2.1 濾紙片法

用打孔器把濾紙片打成直徑為6 mm的濾紙片, 滅菌后分別吸取待測液體, 然后用無菌鑷子把濾紙片放在涂布有供試菌懸液的培養(yǎng)基上, 置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36～48 h, 觀察抑菌圈的大小并做記錄.

2.2.2 牛津杯法

把已滅過菌的牛津杯用鑷子固定在涂布有一定量供試菌懸液的培養(yǎng)基上, 分別向牛津杯中加入100 μL的待測液體, 置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36～48 h, 觀察抑菌圈的大小并做記錄.

2.3 紅茶菌發(fā)酵液的熱處理

用試管取一定量培養(yǎng)至第8天的紅茶菌發(fā)酵液, 放入100℃的水浴鍋內(nèi)進行熱處理15 min, 使發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)變性.

2.4 紅茶菌發(fā)酵液的濃縮

取培養(yǎng)至第8天的紅茶菌發(fā)酵液, 4 000 rpm離心5 min, 取上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在50 ℃條件下將發(fā)酵液濃縮至原體積的一半.

3 結(jié)果

表1 K-A紅茶菌發(fā)酵液對3種細菌的抑菌效果

3.1 紅茶菌發(fā)酵液對供試細菌的抑制作用

取培養(yǎng)8 d的K-A紅茶菌發(fā)酵液, 采用濾紙片法和牛津杯法分別對大腸桿菌(G-)、枯草芽孢桿菌(G+)、金黃色葡萄球菌(G+)進行抑菌試驗, 實驗結(jié)果如表1所示. 從表1可知, K-A紅茶菌液對3種供試細菌有明顯地抑制作用, 說明紅茶菌發(fā)酵液對G+細菌、G-細菌均有抑制作用. 從表1還可看出牛津杯法抑菌試驗中對抑菌圈的觀察效果比濾紙片法更顯著, 所以后續(xù)抑菌試驗均采用牛津杯法進行.

3.2 紅茶菌發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)的初篩

紅茶菌發(fā)酵液成分復(fù)雜, 且含部分具有抑菌活性的物質(zhì), 如紅茶水中的茶多酚[7], 發(fā)酵過程中產(chǎn)生的乙酸等有機酸. 為了尋找K-A紅茶菌發(fā)酵過程中是否產(chǎn)生了其它潛在的抑菌成分, 將未發(fā)酵的茶糖水、相同pH值的乙酸溶液與K-A紅茶菌發(fā)酵液做了如下對照試驗, 結(jié)果見表2.

從表2可以看出, 本實驗中不經(jīng)發(fā)酵的茶糖水對供試菌都沒有抑制作用, 排除了茶水中含有抑菌物質(zhì), 有研究指出紅茶菌發(fā)酵所用的茶糖水中所含的茶多酚具有抑菌效果, 這可能與制備茶糖水時所采用的茶葉品種有關(guān)[8].

表2 K-A紅茶菌發(fā)酵液與茶糖水及相同pH值的醋酸溶液抑菌效果比較

試驗所用的紅茶菌液為發(fā)酵8 d的菌液(pH = 2.4), 由于有機酸的酸堿平衡常數(shù)相差較大, 故采用了與紅茶菌液相同酸度的冰醋酸溶液進行試驗. 從表2可以看出, 2者的抑菌作用較相近, 冰醋酸的抑菌作用略強, 這與冰醋酸本身就具有較強的抑菌效果有關(guān)[9], 和謝俊杰的研究結(jié)果一致[4].

3.3 紅茶菌發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性分析

對紅茶菌發(fā)酵液進行100 ℃熱處理15 min以鈍化可能存在的熱敏性抑菌物質(zhì). 用熱處理及未經(jīng)熱處理的紅茶菌發(fā)酵液分別對供試菌做抑菌試驗, 結(jié)果如表3所示.

表3 K-A紅茶菌發(fā)酵液熱處理前后抑菌效果比較

從表3可以觀察到經(jīng)過熱處理的紅茶菌發(fā)酵液的抑菌圈明顯小于未經(jīng)熱處理的發(fā)酵液, 由于發(fā)酵液中的酸性物質(zhì)被揮發(fā)出來, 所以紅茶菌發(fā)酵液中存在對熱敏感的抑菌物質(zhì), 可能是多肽類或蛋白質(zhì)類物質(zhì), 這與Sreeramulu G和張虎成的研究結(jié)果是一樣的[10—11].

3.4 熱處理的紅茶菌發(fā)酵液濃縮后的抑菌效果

通過旋轉(zhuǎn)蒸餾法將熱處理的紅茶菌發(fā)酵液體積濃縮至原來的1/2, 用NaOH(1 mol/L)調(diào)整pH值至與原發(fā)酵液一致, 所得濃縮發(fā)酵液對3種供試細菌進行抑菌試驗, 試驗結(jié)果如表4所示.

表4 熱處理的K-A紅茶菌發(fā)酵液濃縮前后抑菌效果比較

將熱處理的紅茶菌發(fā)酵液濃縮后, 觀察到其對3種供試細菌的抑菌圈明顯增大, 結(jié)合3.3節(jié)中的結(jié)果—經(jīng)熱處理的紅茶菌液對供試菌的抑菌圈明顯減小, 酸性物質(zhì)被揮發(fā), 可以推斷紅茶菌發(fā)酵液中存在著除有機酸之外的抑菌活性物質(zhì), 且該抑菌物質(zhì)對熱敏感.

3.5 不同地區(qū)的紅茶菌發(fā)酵特征比較

紅茶菌是由醋酸菌、酵母菌和乳酸菌等多種微生物組成的共生菌, 也有研究報道用于發(fā)酵培養(yǎng)紅茶菌的微生物主要是醋酸菌和酵母菌, 未分離到乳酸菌[12]. 本試驗收集到了安徽省和黑龍江省的紅茶菌菌膜, 并對它們的發(fā)酵特征進行了比較, 具體見表5. 從表5中可以看出, 不同來源的紅茶菌發(fā)酵特征差異很大, 說明其微生物組成存在差異, 也暗示了它們在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物各不相同.

表5 K-A紅茶菌和 K-H紅茶菌發(fā)酵特征比較

4 討論

K-A紅茶菌發(fā)酵茶糖水8 d后對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌均有明顯的抑菌作用, 而未經(jīng)發(fā)酵的茶糖水沒有顯示出抑菌活性, 表明紅茶菌發(fā)酵液中的確存在抑菌物質(zhì), 這與謝俊杰等[4]人的研究結(jié)果相同. 通過熱處理試驗和低溫濃縮試驗發(fā)現(xiàn)紅茶菌發(fā)酵液中可能存在對熱敏感的抑菌活性物質(zhì), 例如多肽類或蛋白類物質(zhì), 這為進一步研究紅茶菌發(fā)酵液中的抑菌物質(zhì)明確了方向.

試驗還比較了源自安徽省和黑龍江省的紅茶菌種, 發(fā)現(xiàn)它們的發(fā)酵特征及抑菌活性差異很大. 收集更多區(qū)域的紅茶菌種, 測試它們的抑菌效果, 尋找更多的可能應(yīng)用于食品防腐的抑菌物質(zhì), 是下一步的研究方向.

[1] Aidoo K E, Rob Nout M J, Sarkar P K. Occurrence and function of yeasts in Asian indigenous fermented foods[J]. FEMS Yeast Research, 2006, 6(1): 30—39.

[2] 周幗萍, 汪芳安, 高冰. 醋酸菌篩選培養(yǎng)基的優(yōu)化和優(yōu)良醋酸菌分離的研究[J]. 中國釀造, 2004(6): 18—19.

[3] Steinkraus K H, Shapiro K B, Hotchkiss, et al. Investigations into the antibiotic activity of tea fungus/kombucha beverage[J]. Acta Biotechnol, 1996, 16: 199—205.

[4] 謝俊杰, 鐘青萍, 佘世望, 等. 紅茶菌液抑菌作用的研究[J]. 食品科技, 2000(6): 59—60.

[5] 袁洪業(yè). 保健飲料—海寶茶菌[M]. 北京: 輕工業(yè)出版社, 1981: 57—60.

[6] 賈彩鳳, 王雪梅, 劉敏, 等. 抗生素效價測定實驗的幾點改進[J]. 生物學(xué)通報, 2008, 43(10): 48—49.

[7] 閻守和. 速溶茶生物化學(xué)[M]. 北京: 北京大學(xué)出版社, 1990: 24—25.

[8] Battikh H, Chaieb K, Bakhrouf A, et al. Antibacterial and antifungal activities of black and green kombucha teas[J]. Journal of Food Biochemistry, 2013, 37(2): 231—236.

[9] 劉勝貴,陳鳩鳩, 李軍, 等. 羊耳菊有機溶劑提取物的抑菌作用研究[J]. 遼寧中醫(yī)雜志, 2010, 37(3): 398—400.

[10] Sreeramulu G, Zhu Y, Knol W. Characterization of antimicrobial activity in Kombucha fermentation[J]. Acta Biotechnolo- gica, 2001, 21(1): 49—56.

[11] 張虎成, 范海濤, 楊國偉, 等. 紅茶菌發(fā)酵液抑菌活性研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 40(9): 5340—5342.

[12] Liu C H, Hsu W H, Lee F L, et al. The isolation and identification of microbes from a fermented tea beverage, HaiPao, and their interactions during Haipao fermentation[J]. Food Microbiology, 1996, 8(13): 407—415.

On antibacterial activities of Kombucha fermentation

SHEN Rui-rui1, LI Ya-ke1, WANG Bo-hua2

(1. Furong College of Hunan University of Arts and Science, Changde 415000, China; 2. College of Life Sciences, Hunan University of Arts and Science, Changde 415000, China)

Kombucha fermentation is a beverage obtained by the fermentation of sweetened tea. It’s fermented by a symbiotic culture of bacteria, yeast and fungi. Its chemical composition is complex. K-A kombucha fermented culture showed large inhibition zones against,andby paper disk method and oxford cup method. The results showed that it had evident inhibition effect on growth of both G+bacteria and G-bacteria. And it was found that the antibacterial activity observed is due to not only organic acids, but also other thermosensitive components. The fermentation traits differences between K-A kombucha and K-H kombucha were significant.

Kombucha; fermentation broth; antibacterial activities

10.3969/j.issn.1672-6146.2013.04.007

Q 934

1672-6146(2013)04-0029-04

email: wangbohua0731@yahoo.com.cn;

email: 412003811@qq.com.

2013-10-31

湖南文理學(xué)院2012年度大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)研究項目及湖南省“十二五”重點建設(shè)學(xué)科資助

(責(zé)任編校: 江 河)