環(huán)境因素及COMT基因多態(tài)性與乳腺癌關(guān)系的病例對照研究

李 君，劉 坤，蔣守芳，陳海燕，袁聚祥，牛鳳玲，張國志

（1.湖北文理學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，湖北 襄陽 441053；2.河北聯(lián)合大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，河北 唐山 063000；3.唐山市腫瘤醫(yī)院 乳腺外科，河北 唐山 063000；4.河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院 普外科，河北 唐山 063000）

乳腺癌是最常見嚴重危害女性健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率目前正逐年增高，位居很多大城市女性腫瘤的第一位，已成為對婦女健康威脅最大的疾病，乳腺癌的發(fā)生受到基因遺傳易感性和環(huán)境因素的雙重影響. 以往研究表明，外源性化學(xué)物質(zhì)（有機氯農(nóng)藥等）具有擬雌激素活性，起到內(nèi)分泌干擾作用，唐山市震后為消毒防疫，于1976及1977兩年共使用有機磷農(nóng)藥300余噸，有機氯農(nóng)藥滴滴涕84噸，可濕性六六六粉416噸[1]，而有機氯殺蟲劑可長時間殘留于環(huán)境中，內(nèi)源性與外源性雌激素是引發(fā)乳腺癌的主要危險因素[2]，與雌激素代謝相關(guān)基因的多態(tài)性，可能會影響雌激素的合成或降解，進而影響乳腺癌發(fā)生的危險性. 兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(catechol-O- methyltransferase, COMT)是近年發(fā)現(xiàn)的與乳腺癌雌激素代謝有關(guān)的代謝酶，可通過甲基化使雌激素代謝產(chǎn)物失活[3]，具有基因多態(tài)性，不同的基因型其活性也不同，COMT活性的降低會導(dǎo)致雌激素分解代謝能力發(fā)生變化，從而可能與乳腺癌的易感性相關(guān). 本研究采用1:1配比的病例對照方法，分析環(huán)境因素、COMT基因多態(tài)性與乳腺癌的關(guān)系，為進一步闡明乳腺癌的病因與發(fā)病機制，篩選乳腺癌高危人群，探討乳腺癌的防治策略提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 研究對象

以2010年10月—2011年10月唐山市5所大醫(yī)院就診的新發(fā)女性乳腺癌患者120例為病例，所有病例均經(jīng)病理學(xué)確診，并在唐山本地居住10年以上. 選取與病例同期住院非腫瘤、非生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病女性患者為對照，按年齡差不超過5歲進行1:1配對.

1.2 流行病學(xué)調(diào)查研究方法

1.2.1 調(diào)查方法

本研究根據(jù)統(tǒng)一的調(diào)查表進行流行病學(xué)調(diào)查，調(diào)查表是參照以往《全國惡性腫瘤危險因素監(jiān)測資料》調(diào)查表，并結(jié)合本研究內(nèi)容自行設(shè)計完成的. 調(diào)查員由經(jīng)過培訓(xùn)的人員擔(dān)任，通過訪談式調(diào)查及查閱病歷獲得調(diào)查資料.

1.2.2 調(diào)查內(nèi)容

包括一般特征（年齡、住址、職業(yè)、文化程度、身高、體重）、生活方式（吸煙、飲酒、被動吸煙、體育鍛煉等）、飲食習(xí)慣（豬肉、牛羊肉、腌制食品、油炸食品、蔬菜、水果的食用情況等）、環(huán)境暴露（震后農(nóng)藥暴露、職業(yè)接觸史、居住環(huán)境、飲用水、殺蟲劑使用情況等）、既往病史及家族史（乳腺病史、家族腫瘤史、其他內(nèi)分泌疾病史等）、月經(jīng)生育史（初潮年齡、初產(chǎn)年齡、生育次數(shù)、流產(chǎn)次數(shù)、月經(jīng)情況等）、社會心理（精神刺激史、性格、生活滿意度等）、地震相關(guān)調(diào)查（地震家庭傷亡情況、震后情感狀況、震后一年內(nèi)聞到農(nóng)藥氣味等）.

1.3 實驗檢測

1.3.1 主要實驗儀器與試劑

PCR擴增儀GeneAmp（PCR2400 PE公司）、凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）、紫外可見分光光度計（Smart spec 3000型，美國Bio-Rad公司）、電泳儀（DYY-8C型，北京六一儀器廠）、低溫高速離心機KDC-10 44型（北京醫(yī)用離心機械廠）、微量加樣器（1-1000μL，德國 Eppendorf公司）等.

限制性內(nèi)切酶NlaⅢ（紐英倫生物技術(shù)（北京）有限公司）、2×Taq PCR MasterMix（北京艾德萊生物科技有限公司）、蛋白酶K（華美生物工程公司）、吐溫-100（Tween-100，華美生物工程公司）、三羥甲基氨基甲烷（Tris，Amresco公司）、乙二酰四乙酸二鈉（EDTA，Amresco公司）、PCR Marker（北京艾德萊生物科技有限公司）、溴乙錠（EB，華美生物工程公司）等.

1.3.2 血液樣本的采集及檢測

病例及對照均采集清晨空腹抗凝靜脈血液5ml，-20℃冰箱凍存，待測.

鹽析法提取 DNA 取血樣 2ml移至 15ml離心管中，加入溶血試劑 5-6ml，混勻放置 10min；3500r/min離心30min后，棄上清；加入溶血試劑至5-6ml，用吹管吹開底部固體，放置10min；3500r/min離心30min后，棄上清；離心步驟共重復(fù)3-4遍，洗至粉紅色為止. 倒出上清后，底部固體加入0.25ml核懸浮液，用槍頭吹散；加入5μl蛋白酶K和12ul 10%SDS混勻，37℃水浴6h或過夜. 加0.15ml 6mol/L NaCl，混勻，4℃放置 20min；2800r/min離心 25min；將上清液移至 EP管中；向 EP管中加入 1ml預(yù)冷的無水乙醇，輕輕攪動至絮狀DNA析出為止，-20℃放置15-20min；3500 r/min離心10min后，棄上清，用95%乙醇醇洗1次，70%乙醇醇洗2次，棄上清，干燥；加入50μl TBE，-20℃保存.

COMT基因的擴增 PCR擴增反應(yīng)體系為25μl：Master Mix 12.5μl，上、下游引物各1μl，DNA 2μl，加滅菌水至25μl后混勻. PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min，接著按94℃ 1min、60℃ 30s、72℃ 30s共循環(huán)35次，最后72℃延長10min. 電泳：制內(nèi)含EB 3μg/ml的1.8%的瓊脂糖凝膠，取擴增產(chǎn)物2μl，加少量上樣緩沖液，120V電壓條件下電泳10min，于凝膠成像系統(tǒng)下觀察，若樣品在于PCR Marker相對應(yīng)位置出現(xiàn)條帶，則為有擴增產(chǎn)物，對擴增產(chǎn)物進行酶切.

限制性內(nèi)切酶 NlaⅢ鑒別 COMT基因多態(tài)性 反應(yīng)體系 20μl：包括 DNA15μl，限制性內(nèi)切酶NlaⅢ 0.5μl (10U/μl)，10×NEB 2μl，100×BSA 0.2μl，雙蒸水 2.3μl. 反應(yīng)條件：37℃，3h 恒溫孵育. 電泳后將膠移至凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果：根據(jù)條帶數(shù)（與Marker對照）確定基因型，觀察產(chǎn)物高活性基因型（COMT GG）酶切產(chǎn)物可見到114bp的片段，低活性基因型（COMT AA）可見到96bp的判斷，而雜合子（COMT GA）則可同時出現(xiàn)114bp及96bp的片段.

1.4 質(zhì)量控制

現(xiàn)場調(diào)查質(zhì)量控制：采用1:1配對的病例對照研究，以混雜因素作為匹配條件，控制混雜因素影響. 嚴格按照病例對照篩選標準，盡可能從多個醫(yī)院選取病例，從多科室多病種選擇對照，進而控制選擇偏倚. 查閱大量文獻，制定盡可能全面、具體的調(diào)查表，變量最好為可以量化的客觀指標. 病例與對照調(diào)查表及調(diào)查環(huán)境應(yīng)一致. 培訓(xùn)調(diào)查員，掌握調(diào)查的目的、意義和調(diào)查數(shù)據(jù)的收集方式、詢問語氣和技巧等. 以5%的比例對調(diào)查表進行抽查，對發(fā)現(xiàn)的錯項和漏項進行及時的修改和補填，抽查合格率達到95%以上，進而控制信息偏倚.

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

用Excel建立數(shù)據(jù)庫，用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計分析，病例與對照基本情況及COMT基因多態(tài)性分析的采用配對t檢驗或卡方檢驗，采用單因素條件Logistic回歸和多因素條件Logistic回歸模型分析乳腺癌的危險因素.

2 結(jié)果

2.1 一般情況

本次研究共調(diào)查1:1配對的病例和對照120對，其中病例平均年齡50.57±9.50歲，對照平均年齡50.72±9.90歲，病例和對照間年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.09，P=0.93)；病例120人的婚姻狀況均為已婚，對照中2人未婚，其余118人為已婚. 對研究對象中病例與對照進行職業(yè)、居住地分布、文化程度比較，結(jié)果顯示病例和對照人口學(xué)特征均衡可比.

2.2 環(huán)境危險因素與乳腺癌的關(guān)系

為控制其他因素對乳腺癌的影響，首先進行目前公認的乳腺癌危險因素分析，并將其中有意義的因素作為調(diào)整控制因素后，進行環(huán)境危險因素與乳腺癌關(guān)系的分析.

2.2.1 月經(jīng)生育因素、心理因素、既往病史與家族史與乳腺癌的關(guān)系

采用條件Logistic分析，分析月經(jīng)生育因素、心理因素、既往病史與家族史與乳腺癌關(guān)系，見表1.

表1 月經(jīng)生育因素、心理因素、既往病史及家族史與乳腺癌關(guān)系的單因素條件Logistic回歸分析

續(xù)表1

結(jié)果顯示痛經(jīng)、做過流產(chǎn)、有工作或生活壓力、經(jīng)歷過負性事件、A型性格和愛生氣、乳腺病史、生殖系統(tǒng)疾病史、其他病史、腫瘤家族史、一級親屬患乳腺癌為乳腺癌的危險因素.

2.2.2 飲食習(xí)慣、生活方式因素與乳腺癌的關(guān)系

進一步將月經(jīng)生育因素和社會心理因素及家族史分析中有意義的因素作為調(diào)整因素，進行飲食習(xí)慣及生活方式因素與乳腺癌關(guān)系的分析，由表2可見，被動吸煙≥10年（OR=6.41，95%CI：3.08～13.34）為乳腺癌的危險因素；豆類攝入多（OR=0.29，95%CI：0.14～0.62），高纖維素飲食（OR=0.23，95%CI：0.10～0.52）為乳腺癌的保護因素.

表2 飲食習(xí)慣、生活方式與乳腺癌關(guān)系的單因素條件Logistic回歸分析

2.2.3 生活環(huán)境暴露因素與乳腺癌的關(guān)系

生活環(huán)境暴露因素的單因素條件Logistic回歸分析結(jié)果見表3，經(jīng)月經(jīng)生育因素和社會心理因素及家族史調(diào)整后乳腺癌的環(huán)境危險因素有：居住地環(huán)境污染、室內(nèi)殺蟲劑使用≥5年、職業(yè)接觸及農(nóng)藥使用≥10年，烹調(diào)使用排油煙設(shè)備、地震后一年內(nèi)很少聞到農(nóng)藥氣味為保護因素.

2.2.4 乳腺癌環(huán)境危險因素的多因素Logistic回歸分析

為了控制各個因素之間的混雜影響效應(yīng)，將以上單因素分析有意義的危險因素納入多因素條件Logistic回歸模型，分析結(jié)果由表4所示：居住地環(huán)境污染（OR=13.17），被動吸煙≥10年（OR=17.80），農(nóng)藥使用≥10年（OR=5.66）為乳腺癌危險因素. 地震后一年內(nèi)很少聞到農(nóng)藥氣味（OR=0.10），烹調(diào)時使用排油設(shè)備（OR=0.16）為保護因素.

表3 環(huán)境暴露因素與乳腺癌關(guān)系的的單因素條件Logistic回歸分析

表4 女性乳腺癌環(huán)境因素的多因素條件Logistic回歸分析

3 COMT基因多態(tài)性與乳腺癌的關(guān)系

3.1 COMT基因多態(tài)性電泳結(jié)果

共檢測120對病例與對照的COMT基因多態(tài)性. PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)NlaⅢ酶切后，呈現(xiàn)三種基因型. 純合野生型GG位于第2泳道；雜合基因型GA位于第1、4泳道；純合突變基因型AA位于第3泳道，見圖1.

圖1 NlaⅢ酶切電泳圖

3.2 病例與對照COMT基因型的分布

由表 5可見，病例和對照基因型頻率分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=8.28，P＜0.05)，基因型位點至少攜帶一個突變等位基因（雜合型GA和突變純合型AA）的為易感基因型，野生純合型GG為參照基因型，結(jié)果提示，病例與對照野生型雜合子基因型分布和突變型純合子分布頻率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（OR=1.79，95%CI：0.57～5.56；OR=1.15，95%CI：0.35～3.85），即攜帶雜合型和突變純合型者患乳腺癌的風(fēng)險分別為野生純合型的1.79和1.15倍.

表5 病例和對照COMT基因型的分布比較

4 討論

病因?qū)W探索揭示乳腺癌發(fā)病與許多因素相關(guān)，包括遺傳／家族因素、生殖／內(nèi)分泌因素、生活／行為因素和環(huán)境因素等[4]，國內(nèi)外學(xué)者對于前三類因素進行了廣泛的研究，本研究在分析了月經(jīng)生育史、社會心理因素、既往病史及家族史與乳腺癌的關(guān)系后，采用統(tǒng)計分析方法對這些因素進行了控制，著重探討環(huán)境危險因素與乳腺癌的關(guān)系.

4.1 飲食習(xí)慣、生活方式因素與乳腺癌的關(guān)系

有調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，長期食用高脂肪、高蛋白膳食、單不飽和脂肪酸攝入過高及肥胖均為乳腺癌發(fā)病的危險因素，但膳食脂肪與乳腺癌的相關(guān)性研究結(jié)果也存在不一致. 本研究結(jié)果顯示：豆類攝入多，高纖維素飲食為保護因素，這與大多文獻結(jié)果還是一致的[5-7].

有研究認為吸煙有致癌作用，但由于國內(nèi)女性吸煙者較少，因此把吸煙劃分為主動吸煙和被動吸煙，被動吸煙女性長期吸入煙霧中的致癌物質(zhì)，對乳腺癌發(fā)生起到誘發(fā)和促進作用. 本次研究結(jié)果提示被動吸煙≥10年為乳腺癌的危險因素（OR=17.80，95%CI：4.04～78.47），即被動吸煙≥10年患乳腺癌的危險性是被動吸煙＜10年的17.80倍，這與相關(guān)文獻研究結(jié)果一致[8].

4.2 生活環(huán)境暴露因素與乳腺癌的關(guān)系

隨著工業(yè)化進程的加快，環(huán)境污染日益加重，環(huán)境污染物中的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物（如農(nóng)藥、去污劑等）、化學(xué)致癌物與乳腺癌的關(guān)聯(lián)引起了人們的廣泛關(guān)注. 本次研究結(jié)果經(jīng)月經(jīng)生育因素和社會心理因素及家族史調(diào)整后，進一步進行多因素條件Logistic回歸分析. 結(jié)果顯示，居住地環(huán)境污染、農(nóng)藥使用≥10年、被動吸煙≥10年為乳腺癌危險因素. 而烹調(diào)時使用排油設(shè)備、豆類攝入多則為保護因素. 這與以往大多數(shù)研究結(jié)果一致.

4.3 COMT基因多態(tài)性與乳腺癌的關(guān)系

COMT基因編碼的兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶是雌激素生物代謝階段Ⅱ過程中一個重要的功能酶，能通過甲基化使兒茶酚雌激素失活，使其結(jié)合受體的能力降低，因此COMT在乳腺癌的發(fā)生和進展中作用不容忽視.COMT基因在第4號外顯子存在1個G與A的置換點突變，使其編碼的108或158位氨基酸由纈氨酸被甲硫氨酸取代(Val→Met)，導(dǎo)致活性改變. 當其158位氨基酸為Met時，該酶變?yōu)椴荒蜔幔谏項l件下，其活性也大大降低. COMT活性具3個峰值分布：AA-低活性COMT基因型，AG-中等活性COMT基因型，GG-高活性COMT基因型. 低活性COMT(AA)基因編碼的酶活性比高活性COMT(GG)基因編碼的酶活性低3或4倍. 如果COMT活性較低，則會導(dǎo)致雌二醇4-羥化產(chǎn)物增多，從而增加腫瘤發(fā)生的風(fēng)險.

近年來，國內(nèi)、外學(xué)者對COMT基因多態(tài)性給與了很多關(guān)注，其中COMT基因多態(tài)性與乳腺癌有關(guān)是近年來才發(fā)現(xiàn)的，國內(nèi)有關(guān)研究還很少，國外雖有一些研究，但結(jié)果尚不一致. Matsui[9]等對140例乳腺癌患者研究認為基因型與乳腺癌臨床分期及癌細胞在淋巴系統(tǒng)的擴散有關(guān). 譚文[10]等研究顯示乳腺癌患者的AA基因型頻率為10.4%，顯著高于對照組5.2%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.03). 本研究對120對病例與對照進行了基因型的檢測，GG、GA、AA基因型頻率病例組分別為60.8%、35.0%、4.2%，對照組分別為48.3%、37.5%、14.2%，結(jié)果提示，乳腺癌患者 COMT基因型 AA（158Met）的分布頻率顯著高于對照組，低活性等位基因型可能與乳腺癌的發(fā)生有關(guān)（OR=1.15；95%CI：0.35～3.85）（P=0.04）.

乳腺癌的發(fā)生病因復(fù)雜，人群的環(huán)境暴露是多因素長期低劑量復(fù)合作用，環(huán)境因素暴露評價存在一定難度，因此研究結(jié)果可能存在一定的局限性，需要在不同的人群中進行驗證. 當暴露水平較低或易感基因型頻率較低時，研究環(huán)境因素與易感基因間關(guān)系時需要擴大樣本量來驗證結(jié)論[11].

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