我國西南地區(qū)主要谷物表面污染真菌的分離與分子鑒定*

張小春，田艷萍，陳　昊，陽金甫，蔣芳菲,代　娟△

1.成都醫(yī)學院(成都　610500);2.成都中醫(yī)藥大學(成都　610075)

我國西南地區(qū)主要谷物表面污染真菌的分離與分子鑒定*

張小春1，田艷萍1，陳昊1，陽金甫1，蔣芳菲2,代娟1△

1.成都醫(yī)學院(成都610500);2.成都中醫(yī)藥大學(成都610075)

【摘要】目的了解我國西南地區(qū)2014-2015年產(chǎn)主要谷物污染狀況，探索谷物表面污染真菌的快速鑒定方法。方法利用孟加拉紅培養(yǎng)基進行谷物表面真菌的分離與純化。選用擴增真菌18S序列的通用引物ITS1和ITS4，通過PCR擴增和序列分析進行菌種鑒定。結(jié)果從157份谷物樣品中分離得到277株真菌，利用分子生物學鑒定方法成功鑒定，污染率為42.0%，其中小麥主要侵染真菌為枝孢菌屬、鏈孢霉屬和小光腔菌屬，玉米、大米主要侵染真菌為鏈孢霉屬、曲霉菌屬和青霉菌屬。結(jié)論我國西南地區(qū)谷物樣品的污染現(xiàn)象比較普遍，產(chǎn)毒菌株污染較為嚴重，存在潛在風險。選用的引物通用性較好，可用于谷物表面污染真菌的鑒定。

【關(guān)鍵詞】谷物；真菌污染；聚合酶鏈式反應(yīng)；分子鑒定

谷物的真菌污染是一個全球性的食品安全問題。聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)統(tǒng)計，全世界約25%的谷物遭受不同程度的真菌及其毒素污染，我國谷物污染情況更為嚴重[1]。部分真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物真菌毒素可能具有致癌、致畸、致突變、中毒性腎損害、肝細胞損害、免疫抑制和生殖紊亂等毒性，給人和動物的健康造成巨大隱患[2-3]。近年來，隨著谷物農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量安全受到越來越多關(guān)注，有關(guān)谷物真菌污染分析的報道越來越多[4-6]。我國西南地區(qū)是糧食主產(chǎn)區(qū),季節(jié)多變,氣候潮濕,極易導致糧食的霉變，但有關(guān)我國西南地區(qū)主要谷物真菌污染情況的調(diào)查資料還很缺乏。由于谷物種類多，基質(zhì)復(fù)雜，因此，對谷物中真菌污染的早期、快速、準確檢測是預(yù)防和控制谷物真菌污染的關(guān)鍵?；贗TS 序列的真菌分子鑒定方法具有高效、可靠等特點[7-8]，目前已有在農(nóng)產(chǎn)品、化妝品、中藥材、臨床標本等污染真菌分析方面的研究報道[9-12]，但尚未見用于谷物表面污染真菌的鑒定。本研究從我國西南地區(qū)收集谷物樣品，包括小麥、玉米和大米，對表面污染真菌進行分離純化，采用真菌通用引物ITS1和ITS4，通過PCR擴增與測序的方法,對真菌進行分子生物學鑒定，為了解谷物真菌污染狀況，建立谷物真菌污染快速鑒定方法提供科學依據(jù)。

1材料與方法

1.1樣品來源

根據(jù)地理位置、氣候條件等情況，選擇四川、重慶、云南和貴州為采樣點。為保證所采樣品的代表性，隨機采集各省各市(區(qū)) 縣食品污染物監(jiān)測點超市、集貿(mào)市場及農(nóng)家的谷物，共采集2014—2015年產(chǎn)小麥、玉米、大米樣品157份(表1)。樣品采集后置于無菌拉封袋獨立密封，編號并記錄，于陰涼干燥處保存。

表1　谷物樣品信息

1.2試劑

植物基因組DNA提取試劑盒、2×Taq PCR MasterMix、瓊脂糖和DNA Marker II購自天根生化科技北京有限公司；孟加拉紅培養(yǎng)基購自杭州微生物試劑有限公司。

1.3儀器

PCR 儀，MyCycler(美國 Bio-rad)；生物安全柜，HFsafe-1200TE(上海力申科學儀器有限公司)；超純水儀，Rios-5 /Milli-Q Synthesis(美國 Millipore)；滅菌鍋，HVE-50(日本 Hirayama)。

1.4方法

1.4.1谷物表面污染真菌的分離與純化取谷物樣品25.0 g，置于225.0 mL無菌生理鹽水中，充分震蕩混勻。將樣品溶液依次稀釋至10%、1%、0.1%后，分別取100 μL涂布于孟加拉紅培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)5～7 d，每個濃度各接種2個重復(fù)。觀察菌落，待純化后轉(zhuǎn)移到孟加拉紅斜面中保存，用于菌種鑒定。除不加谷物外，其余步驟同樣處理，作為陰性對照。污染率=分離出真菌的谷物樣品數(shù)/總的檢測谷物樣品數(shù)×100%。

1.4.2真菌基因組DNA提取將適量菌落放入研缽中，加入液氮快速研磨。抽提采用植物基因組DNA提取試劑盒，具體參照試劑盒說明書進行，電泳觀察，最后將抽提的DNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3PCR 擴增及產(chǎn)物測序選用擴增真菌18 S序列的通用引物ITS1和ITS4[13]，由成都擎科生物工程公司合成。引物序列如下：引物ITS1: 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，引物ITS4: 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR反應(yīng)體系：2 ×Taq PCR Master Mix緩沖液25 μL，10 μM引物各2.5 μL，真菌基因組DNA 5 μL，ddH2O加至50 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min；54 ℃退火1 min；72 ℃延伸1.5 min； 最后72 ℃延伸10 min；35個循環(huán)；4 ℃保存。PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳觀察是否有目的條帶，并送成都擎科生物工程公司測序。

1.4.4DNA 序列比對及分析將所測得的序列提交美國NCBI的GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫(http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進行同源性搜索。找出與獲得片段同源性最高的真菌菌株的參考序列。

2結(jié)果

2.1谷物表面污染真菌分離與純化

本實驗對采集的157份谷物樣品進行了真菌分離，結(jié)果從10份小麥樣品，48份玉米樣品，8份大米樣品，共計66份樣品中分離到277株菌株，部分谷物樣品分離到4株或4株以上真菌，污染率達42.0%，表明谷物表面真菌污染情況較為普遍。部分菌株的菌落形態(tài)見圖1。

2.2PCR擴增產(chǎn)物電泳

采用植物基因組DNA提取試劑盒提取DNA，基于通用引物ITS1、ITS4進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，277株真菌菌株均能擴增出目的條帶，不同分離株擴增產(chǎn)物為400～600 bp(圖2)。

圖1部分污染真菌的菌落形態(tài)

圖2PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

注: 1～12: 分離的部分真菌的PCR擴增產(chǎn)物；M: DNA Marker

2.3真菌的分子鑒定

將277株真菌菌株的測序結(jié)果進行Blast檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，277株真菌與GenBank 中已注冊的鏈孢霉屬(Neurosporaspp.)、曲霉菌屬(Aspergillusspp.)、青霉菌屬(Penicilliumspp.)等菌屬匹配度較好，序列一致性在96%以上，其中鏈孢霉屬、曲霉菌屬、青霉菌屬、枝孢菌屬(Cladosporiumspp.)、擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsisspp.)、小光腔菌屬(LeptosphaerulinaChartarumspp.)、鏈格孢屬(Alternariaspp.)、木霉屬(Trichodermaspp.)的分離率分別為25.9%、22.4%、12.3%、8.7%、5.4%、5.4%、4.0%、3.6%。小麥中主要侵染真菌為枝孢菌屬、鏈孢霉屬和小光腔菌屬。玉米、大米主要侵染真菌為鏈孢霉屬、曲霉菌屬和青霉菌屬(表2)。

表2　不同樣品的污染菌類群

3討論

與傳統(tǒng)的真菌形態(tài)學鑒定方法相比，真菌分子鑒定大大提高了鑒定效率。ITS 序列為公認的真菌分子鑒定首選序列，本實驗選用引物ITS1和ITS4成功鑒定了谷物表面污染的277株真菌，污染率達42.0%，主要污染菌為鏈孢霉屬、曲霉菌屬、青霉菌屬等，這一結(jié)果與鏈孢霉屬、曲霉菌屬、青霉菌屬是谷物污染的主要檢出菌相符合[14-15]，地區(qū)間差異不大。選用的引物通用性較好，PCR擴增和測序成功率為100%，可用于谷物表面污染真菌的鑒定。

本研究首次對西南地區(qū)主要谷物的真菌污染情況進行調(diào)查，結(jié)果與馬皎潔等[16]的研究一致，谷物樣品的污染比較普遍，其中曲霉菌、青霉菌為主要產(chǎn)毒菌株，污染較為嚴重，分離率為22.4%、12.3%，谷物的真菌污染存在潛在風險。同時各谷物品種間污染真菌的種類也有所差異，玉米污染情況最為嚴重。原因可能與谷物的基質(zhì)、品種、收獲季節(jié)、當?shù)貧夂驐l件、儲存方式等因素有關(guān)。由于真菌的廣泛存在，尤其一些產(chǎn)毒真菌，可產(chǎn)生肝臟毒性、血液毒性、免疫毒性和遺傳毒性，并進一步誘發(fā)腫瘤等疾病，嚴重威脅人類健康。因此，加強谷物污染真菌的監(jiān)測,有利于對儲藏糧食的科學管理,減少或避免糧食霉變造成的損失，為谷物的食用安全提供保障。如何更好地預(yù)防谷物在生產(chǎn)、加工、儲藏過程中真菌污染及毒素的形成，仍需進一步研究。

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Separation and Molecular Identification of Fungal Contamination on Surfaces of Cereal Samples Collected in the Southwest of China

ZhangXiaochun1,TianYanping1,ChenHao1,YangJinfu1,JiangFangfei2,DaiJuan1△.

1.ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China；2.ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,Chengdu610075,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the fungal contamination of cereal samples collected in the Southwest of China from 2014 to 2015 and explore a rapid method for identifying the fungi of contaminating the cereal surfaces.MethodsThe Rose Bengal Medium was used to isolate and purify the fungi on the surfaces of cereal samples. The primers including ITS1 and ITS4 were employed to amplify the fungal sequences of 18S and the polymerase chain reaction (PCR) and the sequence analysis was adopted to identify the strains. Results277 fungal strains were obtained from the surfaces of 157 cereal samples and identified with the identification method of molecular biology, which showed that the contamination rate of the samples was 42.0%.The major contamination fungi of wheats were cladosporium spp., neurospora spp. and leptosphaerulina chartarum spp., and those of corns and grains were neurospora spp., aspergillus spp. and penicillium spp. ConclusionThe cereals are contaminated universally in the southwest of China. The contamination of toxicogenic strains is more serious, which brings about potential risks. The selected primers have strong universality and can be used to identify the fungi of contaminating the cereal surfaces.

【Key words】Cereals; Fungal contamination; Polymerase chain reaction (PCR) ; Molecular identification

doi:10.3969/j.issn.1674-2257.2016.02.012

*基金項目：四川省教育廳一般項目(No：15ZB0247)；四川省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計劃項目(No：201513705057)

通信作者：△代娟，E-mail：daijuan_2004_2007@126.com

【中圖分類號】R155.5

【文獻標志碼】A

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20160418.1124.012.html

·論著·