建設(shè)精品實(shí)驗(yàn)，促進(jìn)實(shí)驗(yàn)教學(xué)

【摘要】《基因工程實(shí)驗(yàn)》是生命學(xué)科中的一門(mén)十分重要的實(shí)踐課。其方法與技術(shù)已廣泛滲透到現(xiàn)代生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域， 成為生命科學(xué)的一門(mén)核心技術(shù)。實(shí)驗(yàn)課程的教學(xué)好壞不僅直接關(guān)系到學(xué)生的專(zhuān)業(yè)素質(zhì)和創(chuàng)新能力的培養(yǎng)，更為直接的效果就是將來(lái)進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室是否具有一個(gè)扎實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本文就基因工程實(shí)驗(yàn)中通過(guò)建設(shè)Western Blot精品實(shí)驗(yàn)課程來(lái)帶動(dòng)實(shí)驗(yàn)教學(xué)進(jìn)行了初步探討與分析。

【關(guān)鍵詞】基因工程實(shí)驗(yàn) 精品課程 Western Blot 基因工程實(shí)驗(yàn)

【中圖分類(lèi)號(hào)】G64 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】2095-3089（2013）03-0049-01

1.實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的內(nèi)涵

Western Blot是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實(shí)驗(yàn)方法。其基本原理是通過(guò)特異性抗體對(duì)凝膠電泳處理過(guò)的細(xì)胞或生物組織樣品中的蛋白質(zhì)進(jìn)行著色。通過(guò)分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中的表達(dá)情況的信息。所以，可以在疾病檢測(cè)和探索疾病的發(fā)病機(jī)制等方面發(fā)揮重要作用。一個(gè)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的內(nèi)涵高低，可以從這個(gè)實(shí)驗(yàn)的經(jīng)典屬性看出，作為生物學(xué)領(lǐng)域被人們津津樂(lè)道的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)，理應(yīng)具有較好的內(nèi)涵。綜上所述， Western Blot的內(nèi)涵可以定位為以解決實(shí)際醫(yī)療檢測(cè)為目標(biāo)導(dǎo)向，以幫助學(xué)生掌握生物學(xué)研究的基本技術(shù)為主要目的生物學(xué)經(jīng)典實(shí)驗(yàn)[1-4]。

2.實(shí)驗(yàn)教學(xué)的目的

（1）增強(qiáng)學(xué)生主觀能動(dòng)性：在精品實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目Western Blot的教學(xué)過(guò)程中，老師不僅僅是單一地告訴學(xué)生實(shí)驗(yàn)原理，然后讓學(xué)生簡(jiǎn)單重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟。而是通過(guò)將課堂上學(xué)習(xí)的知識(shí)與將來(lái)科研中可能遇到的問(wèn)題相結(jié)合，引導(dǎo)了學(xué)生探求問(wèn)題的好奇心，在老師啟發(fā)式教學(xué)的引導(dǎo)下，學(xué)生學(xué)習(xí)的主觀能動(dòng)性在潛移默化中得到增強(qiáng)。

（2）培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新能力：在教學(xué)過(guò)程中，鼓勵(lì)學(xué)生提出創(chuàng)新性意見(jiàn)；同時(shí)，在實(shí)驗(yàn)分析時(shí)，鼓勵(lì)學(xué)生通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)的理解優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。使得學(xué)生不僅僅在被動(dòng)地接受知識(shí)，而能夠有創(chuàng)新性的思維，以增強(qiáng)學(xué)生的創(chuàng)新能力。

（3）增強(qiáng)學(xué)生與老師的交流：在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，學(xué)生與老師互動(dòng)，共同討論相關(guān)問(wèn)題，共同提高。

3.實(shí)驗(yàn)教學(xué)的方法

（1）實(shí)驗(yàn)前，讓學(xué)生通過(guò)查找文獻(xiàn)或教材去理解和掌握Western Blot的原理和方法。

（2）電泳膠的制備：①安裝夾心式垂直板電泳槽。②根據(jù)所測(cè)蛋白質(zhì)的分子量范圍，選擇適宜的分離膠濃度。③利用雙蒸水、Acr-Bis、Tris-HCl、10%SDS、10%AP和TEMED等分別配制下層分離膠和上層濃縮膠（先不加入TEMED）。④先配制分離膠并灌注，然后在頂端一側(cè)加入1ml異丙醇封住，室溫待其凝聚后去掉上層的異丙醇并用去離子水清洗，再配制濃縮膠并灌注，插入梳子待膠凝聚。

（3）待膠凝固后拔出梳子，組裝電泳設(shè)備，加入電泳緩沖液后點(diǎn)樣品。

（4）120V電壓恒壓電泳1.5小時(shí)左右至溴酚藍(lán)接近膠的底部時(shí)終止電泳。

（5）使用PVDF膜和Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜裝置轉(zhuǎn)膜，設(shè)置轉(zhuǎn)膜電流為300-400mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間一般根據(jù)目的蛋白的分子量大小決定：目的蛋白的分子量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越長(zhǎng)；目的蛋白的分子量越小，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越短。

（6）膜的封閉：①用1xTBST室溫漂洗3次，每次10min，以盡量洗去轉(zhuǎn)印膜上的SDS，防止影響后面的抗體結(jié)合。②取漂洗的轉(zhuǎn)印膜，放入5% No-fat milk的封閉液內(nèi)，搖床震動(dòng)，室溫封閉2h。③用1xTBST室溫漂洗3次，每次10min。

（7）抗體雜交：①封閉后的雜交膜放入雜交袋中，加入抗體稀釋液稀釋的一抗封口，4℃孵育過(guò)夜或室溫?fù)u動(dòng)孵育2h。②洗膜3次，每次10min。③加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1h，④洗膜3次，每次10min。

（8）檢測(cè)：較常用的檢測(cè)系統(tǒng)有辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗的的增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL），還有堿性磷酸酶（AP）標(biāo)記的二抗結(jié)合NBT/BCIP顯色法，其中前者需要掃描儀才能最后讀出實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)硬件要求較高；而后者則可以直接在雜交膜上顯色，因此本實(shí)驗(yàn)采用后者。①按照1ml 1xAP反應(yīng)緩沖Buffer中各加 50μl NBT及BCIP 溶液的比例配置顯色液。②把經(jīng)洗滌的PVDF或NC膜浸入生色底物混合物中，于室溫平緩搖動(dòng)進(jìn)行溫育反應(yīng)。③細(xì)心觀察反應(yīng)過(guò)程，當(dāng)?shù)鞍讕У念伾疃冗_(dá)時(shí)，把膜浸入水中停止反應(yīng)。④拍攝膜照片或直接保存膜留作永久實(shí)驗(yàn)紀(jì)錄。

（9）學(xué)生分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果并提出具創(chuàng)新性的問(wèn)題。

（10）完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告。

4.實(shí)驗(yàn)教學(xué)的考核

Western Blot作為生物學(xué)經(jīng)典實(shí)驗(yàn)，能很好地培養(yǎng)學(xué)生的綜合素質(zhì)和創(chuàng)新能力。而作為精品實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，該實(shí)驗(yàn)的考核要區(qū)別于傳統(tǒng)的考核方式。以前實(shí)驗(yàn)的考核主要以實(shí)驗(yàn)報(bào)告為唯一的依據(jù)，并不能完全地反饋學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)的實(shí)際掌握情況。因此，我們采用綜合評(píng)定的方式。學(xué)生查閱資料的情況、學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)的理解、實(shí)驗(yàn)操作的過(guò)程和對(duì)待實(shí)驗(yàn)的態(tài)度都列入評(píng)分，計(jì)入實(shí)驗(yàn)成績(jī)。通過(guò)這種綜合評(píng)價(jià)方式，可以使學(xué)生認(rèn)真地思考每個(gè)實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)，注重實(shí)驗(yàn)操作能力的提高，使學(xué)生養(yǎng)成嚴(yán)謹(jǐn)求實(shí)的科研態(tài)度，全面提升學(xué)生的綜合素質(zhì)。

5.結(jié)束語(yǔ)

Western Blot是一門(mén)柔和了基礎(chǔ)性、設(shè)計(jì)性和探索性要素的生物學(xué)經(jīng)典實(shí)驗(yàn)。 它能夠?qū)⒄n堂上的理論知識(shí)與具體實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，增強(qiáng)學(xué)生的主觀能動(dòng)性，促進(jìn)學(xué)生分析問(wèn)題，解決問(wèn)題的實(shí)踐能力和創(chuàng)新能力等多方面能力的培養(yǎng)和提高[5-6]。

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