MTT法測(cè)定棉酚對(duì)多浪羊淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

王娟娟，賈山嶺，萬新軍，李蓮瑞

摘要：通過MTT法測(cè)定棉酚對(duì)多浪羊淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，確定棉酚對(duì)多浪羊淋巴細(xì)胞產(chǎn)生影響的最短作用時(shí)間和最低濃度，用于指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐。從新疆多浪羊外周血分離淋巴細(xì)胞，將其加入10 mL的 RPMI-1640中，均勻加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于CO2 培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)12 h后，分別以不同濃度（5、10、15、20、25、30、35 μmol/L）的棉酚進(jìn)行作用，作用時(shí)間分別為1、2、3、4、5、6 h，加入MTT培養(yǎng)4 h，加入DMSO溶液終止反應(yīng)，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于490 nm處檢測(cè)各孔的吸光值。結(jié)果表明，隨著棉酚作用濃度及作用時(shí)間的遞增，多浪羊淋巴細(xì)胞活性在逐漸下降，說明棉酚對(duì)多浪羊的淋巴細(xì)胞活性有明顯的抑制作用。

關(guān)鍵詞：MTT；棉酚；新疆多浪羊；淋巴細(xì)胞；影響

中圖分類號(hào)：S816.43 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）05-1098-04

The Effect of Gossypol on Lymphocyte Growth of Duolang Sheep by MTT

WANG Juan-juana，JIA Shan-linga，WAN Xin-junb，LI Lian-ruib

（Tarim University， a.College of Life Science； b.College of Animal Science， Alar 843300， Xinjiang，China）

Abstract： The effect of gossypol on the growth of Duolang sheep lymphocyte was detected by MTT assay. The object was to determine the shortest time and lowest concentration of gossypol on lymphocyte， and then used to practice. The lymphocyte was isolated from the peripheral blood of Xinjiang Duolang sheep， then added into 10 mL RPMI-1640 and even allocated to 96-well cell culture plate. After cultured in CO2 incubator at 37 ℃ for 12 h， the lymphocytes were treated with gossypol of different concentrations （5， 10， 15， 20， 25， 30， 35 μmol/L） for 1， 2， 3， 4， 5， 6 h， and then added MTT to culture 4 h. At last the reaction was stopped by adding DMSO solution. The absorbance of each well was detected by ELISA at OD490 nm . The results showed that the activity of Duolang sheep lymphocytes decreased with the increase of gossypol concentration and acting time. It indicated that gossypol had obvious inhibitory effect on the Xinjiang Duolang sheep lymphocytes.

Key words： MTT； gossypol； Xinjiang Duolang sheep； lymphocyte； effect

棉酚（Gossypol，GL）存在于錦葵科某些植物的根、莖、種子中，曾作為男性節(jié)育藥為人們所熟知[1]。研究表明，棉酚還是一種新型的抗實(shí)體瘤藥物[2]，化學(xué)結(jié)構(gòu)為8，8′-二醛基-1，1，6，6′，7，7′-六羥基-5，5′-二異丙基-3，3′-二甲基-2，2′聯(lián)萘，相對(duì)分子質(zhì)量為518.54[3]，棉酚制劑主要有3種，分別為醋酸棉酚、精制棉酚及甲酸棉酚。棉酚具有明顯的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力[4，5]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2010年新疆棉花產(chǎn)量為260萬t，約占全國(guó)棉花總產(chǎn)量的40%，世界棉花總產(chǎn)量的11%。根據(jù)俄羅斯農(nóng)業(yè)科學(xué)院有機(jī)化學(xué)研究所的一個(gè)科學(xué)小組研究發(fā)現(xiàn)，以往被人們認(rèn)為廢棄物的棉花的其他部分也是寶貴資源，利用其可生產(chǎn)出大約1 200種制劑、提煉出100多種有機(jī)化合物，同時(shí)也是畜禽飼料方面的好原料[6]；另外棉子餅同大米和小麥相比，不僅蛋白質(zhì)含量高出5～8倍，棉子餅水解后還可得到17種氨基酸，是畜牧業(yè)生產(chǎn)中最物美價(jià)廉的蛋白質(zhì)來源[7]，這就為新疆的農(nóng)牧民提供了大量廉價(jià)的飼料資源，尤其是在新疆畜牧業(yè)的快速發(fā)展、蛋白質(zhì)飼料短缺的局面越來越嚴(yán)重的情況下，大量廢棄的棉子殼無疑是廣大農(nóng)牧民極為廉價(jià)的優(yōu)質(zhì)飼料。但由于棉子殼中含有棉酚類物質(zhì)，當(dāng)達(dá)到一定量時(shí)，會(huì)對(duì)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生毒害作用。研究棉酚引起動(dòng)物細(xì)胞和組織中毒的最小劑量，對(duì)于最大限度地降低由于棉酚中毒而給畜牧業(yè)帶來的損失具有重要的作用。

MTT比色法是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法，其檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能，二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收度值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。因此運(yùn)用MTT法研究棉酚對(duì)新疆多浪羊淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)的影響能夠?yàn)槲覀兏M(jìn)一步研究棉酚對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的影響提供重要的參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 多浪羊（Duolang sheep）由塔里木大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院試驗(yàn)站提供。

1.1.2 試驗(yàn)藥劑 青霉素（山西泰盛制藥有限公司），鏈霉素（新泰生物有限公司），枸櫞酸鈉（塔里木大學(xué)畜牧科技學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室配制），人淋巴細(xì)胞分離液（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所）、MTT（噻唑藍(lán)，上海普飛生物技術(shù)有限公司）；DMSO（二甲基亞砜，Sigma公司），RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco），PBS緩沖液。

1.1.3 儀器設(shè)備 電子天平（BS124S，北京市賽凝膠多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；超凈工作臺(tái)（SW-CJ-2F型，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；全自動(dòng)攝影生物顯微鏡（DP70+B10-OlysLIA，日本奧林巴斯）；電子萬用爐（DL-1型，北京永光明醫(yī)療儀器廠）；紫外可見分光光度計(jì)（Golds54型，上海棱光技術(shù)有限公司）；PCR儀；電泳槽（DYCZ-28A ，北京六一儀器廠）；電腦三恒多用電泳儀（DYY-60C型，北京六一儀器廠）；凝膠成像分析系統(tǒng)（Tanon-4100，上海天能科技有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試劑的配制

1）MTT的配制：稱取0.5 g MTT，加入 100 mL的PBS磷酸緩沖液（NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4 1.44 g，KH2PO4 0.24 g，調(diào)節(jié)pH 為7.4，定容至1 L，用0.22 μm濾膜過濾除去溶液里的細(xì)菌，于4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆茫涑蓾舛葹? mg/mL的 MTT儲(chǔ)存液，于-20 ℃冰箱避光儲(chǔ)存（注意：MTT變?yōu)榛揖G色時(shí)就絕對(duì)不能再用了，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解）。進(jìn)行試驗(yàn)的時(shí)候一般關(guān)閉超凈工作臺(tái)上的日光燈來避光較好。

2）RPMI-1640的配制：稱取 0.062 5 g 青霉素（160 IU），0.1 g鏈霉素（100 IU），用10 mL滅菌蒸餾水溶解。將青霉素、鏈霉素混合液與RPMI-1640 （袋裝粉劑）混合，滅菌蒸餾水定容至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH至7.1左右，分裝后于-20 ℃以下保存。

3）枸櫞酸鈉溶液配制：枸櫞酸鈉3.8 g溶于100 mL滅菌蒸餾水中。

4）無鈣鎂Hanks液配制：①儲(chǔ)存液：NaCl 0.80 g；KCl 0.4 g；Na2HPO4·12H2O 0.152 g； KH2PO4 0.06 g；葡萄糖0.10 g。將稱量好的藥品加滅菌蒸餾水，使各組分溶解后，加入0.4 %酚紅溶液50 mL，加滅菌蒸餾水定容至100 mL，4 ℃冰箱保存。②應(yīng)用液：臨用前將原液用滅菌蒸餾水做10倍稀釋，用無菌的5.5%的NaHCO3調(diào)節(jié)pH至7.2～7.4（配制時(shí)應(yīng)注意所用的玻璃器皿必須潔凈；各種藥品稱量應(yīng)準(zhǔn)確，要求用分析純?cè)噭?；?chǔ)存液可加入2 mL氯仿以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，儲(chǔ)存液配好后，瓶口須用橡皮塞塞緊，放4 ℃冰箱內(nèi)保存，使用期最長(zhǎng)為3個(gè)月；應(yīng)用液配好后，經(jīng)高壓滅菌，4 ℃冰箱內(nèi)保存，可供1個(gè)月內(nèi)使用，用前需再次調(diào)整pH）。

1.2.2 MTT試驗(yàn)原理 活細(xì)胞線粒體中琥珀酸脫氫酶能夠代謝還原MTT，同時(shí)在細(xì)胞色素C的作用下，生成藍(lán)色（或藍(lán)紫色）不溶于水的甲瓚（Formazan），甲瓚的多少可以用酶標(biāo)儀在490 nm處進(jìn)行測(cè)定。在通常情況下，甲瓚生成量與活細(xì)胞數(shù)成正比，因此可根據(jù)吸光度值推測(cè)出活細(xì)胞的數(shù)目。由于死細(xì)胞中不含琥珀酸脫氫酶，加入MTT后不會(huì)出現(xiàn)類似的反應(yīng)，根據(jù)其對(duì)應(yīng)的值就可反映出活細(xì)胞的相對(duì)情況。

1.2.3 試驗(yàn)步驟

1）淋巴細(xì)胞的分離。采集健康成年多浪羊新鮮抗凝血與Hanks液等比例混勻，然后將混合液與淋巴細(xì)胞分離液按體積比2∶1混合后輕輕沿管壁加入玻璃管中，以2 000 r/min離心30 min后，可看見清晰的分層，分別為血漿層、淋巴細(xì)胞層、分離液層、紅細(xì)胞層，用移液器小心將淋巴細(xì)胞層吸出，然后將淋巴細(xì)胞懸浮于10 mL RPMI-1640中輕輕混合均勻，分別依次加入96孔板中。

2）不同濃度棉酚作用于多浪羊淋巴細(xì)胞。將用DMSO（二甲基亞砜）助溶的50 mmo/L的棉酚儲(chǔ)存液取出，將其加入RPMI-1640稀釋的淋巴細(xì)胞懸液中，為確保棉酚的作用時(shí)間分別為1、2、3、4、5、6 h，而MTT的作用時(shí)間為4 h，從96孔板的右邊第11、12列開始加入棉酚，從上到下（即第1排到第8排，下同）依次加入棉酚，使得棉酚的終濃度分別為0、5、10、15、20、25、30、35 μmol/L，然后放入37 ℃、CO2濃度為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，此時(shí)加入棉酚以確保棉酚對(duì)新疆多浪羊淋巴細(xì)胞的作用時(shí)間為6 h。

在第二小時(shí)的時(shí)候，將96孔板細(xì)胞培養(yǎng)板從CO2培養(yǎng)箱中取出，按上述方法在第9、10列加入棉酚，終濃度按從上到下分別為0、5、10、15、20、25、30、35 μmol/L ，此時(shí)加入棉酚以確保棉酚對(duì)新疆多浪羊淋巴細(xì)胞的作用時(shí)間為5 h，然后將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板放入37 ℃、CO2濃度為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

在第三小時(shí)的時(shí)候，按上述方法在第7、8列加入棉酚，此時(shí)可確保棉酚對(duì)新疆多浪羊淋巴細(xì)胞的作用時(shí)間為4 h。此時(shí)，將配制好的5 mg/mL的 MTT儲(chǔ)存液取出，用排槍從96孔板從右往左每孔加入20 μL MTT溶液，這是MTT與細(xì)胞作用的第一小時(shí)，然后再將96孔板放入37 ℃、CO2濃度為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

在第四小時(shí)的時(shí)候，依照上述方法，在第5、6列加入棉酚，使棉酚的終濃度分別為0、5、10、15、20、25、30、35 μmol/L，此時(shí)，MTT的作用時(shí)間為2 h。同樣，第五和第六小時(shí)也按照上述方法加入棉酚，這樣，既確保了棉酚的作用時(shí)間分別為1、2、3、4、5、6 h，也可以保證MTT的作用時(shí)間達(dá)到4 h，然后放入37 ℃、CO2濃度為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3）DMSO終止培養(yǎng)。每孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在490 nm處測(cè)量各孔的吸光值。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各設(shè)2個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉酚對(duì)新疆多浪羊淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

2.1.1 棉酚不同作用時(shí)間對(duì)新疆多浪羊淋巴細(xì)胞活性的影響 從表1和圖1中可以看出，隨著棉酚作用時(shí)間的遞增，新疆多浪羊淋巴細(xì)胞吸光度值在2 h以內(nèi)呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，并在2 h時(shí)達(dá)到峰值。2 h以后，隨著時(shí)間的進(jìn)一步遞增，新疆多浪羊淋巴細(xì)胞的吸光度值呈現(xiàn)遞減的趨勢(shì)，且均小于對(duì)照。這是由于活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中（死細(xì)胞無此功能），所以，MTT所測(cè)得的吸光度值越大，表明其活細(xì)胞的含量越高，活性越強(qiáng)。試驗(yàn)結(jié)果表明棉酚在作用2 h的時(shí)候，新疆多浪羊淋巴細(xì)胞的活性最大，隨后，由于棉酚進(jìn)入細(xì)胞，長(zhǎng)時(shí)間的作用對(duì)細(xì)胞造成了損傷，細(xì)胞自身的修復(fù)作用并不能維持其自身活性，其酶活力下降，甚至有大量的細(xì)胞出現(xiàn)了凋亡。

2.1.2 棉酚不同作用濃度對(duì)新疆多浪羊淋巴細(xì)胞活性的影響 圖2為不同作用濃度的棉酚對(duì)新疆多浪羊淋巴細(xì)胞吸光度值的影響結(jié)果。由圖2可見，在棉酚濃度為5～15 μmol/L的范圍內(nèi)，新疆多浪羊淋巴細(xì)胞吸光度值表現(xiàn)為遞增，且在15 μmol/L的濃度下達(dá)到最大，以后則一直呈現(xiàn)遞減，在35 μmol/L的棉酚濃度下，其吸光度值達(dá)到了最低。這主要是因?yàn)樵诿薹訚舛葹? μmol的時(shí)候，對(duì)新疆多浪羊淋巴細(xì)胞產(chǎn)生較大程度的損傷，但是隨著其濃度的遞增，新疆多浪羊淋巴細(xì)胞本身的免疫系統(tǒng)會(huì)隨著外源不利因素的遞增而出現(xiàn)自身功能性的修復(fù)作用，此時(shí)細(xì)胞的活性會(huì)增強(qiáng)，代謝能力也會(huì)加強(qiáng)，同時(shí)，隨著棉酚作用時(shí)間的遞增，新疆多浪羊淋巴細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱中也會(huì)生長(zhǎng)，尤其是在新疆多浪羊淋巴細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，其細(xì)胞個(gè)數(shù)會(huì)增多，體積會(huì)變大，所以相應(yīng)細(xì)胞活力也會(huì)增強(qiáng)，活細(xì)胞的個(gè)數(shù)也會(huì)增多，此時(shí)新疆多浪羊淋巴細(xì)胞的吸光度值就會(huì)出現(xiàn)短暫的遞增。但隨著棉酚濃度的進(jìn)一步增大，對(duì)新疆多浪羊淋巴細(xì)胞的損傷程度也達(dá)到了最大，其自身的修復(fù)作用已經(jīng)不能維持正常的生理活動(dòng)，此時(shí)測(cè)得的吸光度值就會(huì)遞減，且在35 μmol/L的濃度下其吸光度值達(dá)到最低。

2.2 分析

在棉酚不同濃度及不同時(shí)間作用下，棉酚對(duì)新疆多浪羊外周血淋巴細(xì)胞產(chǎn)生了不同的影響。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著棉酚作用濃度的增大，在2 h作用時(shí)間范圍內(nèi)，新疆多浪羊外周血淋巴細(xì)胞的吸光度值是逐漸增大的，而在2 h以后，新疆多浪羊外周血淋巴細(xì)胞的吸光度值遞減，說明在2 h內(nèi)新疆多浪羊淋巴細(xì)胞的活性還能維持自身的生長(zhǎng)需要，2 h以后則會(huì)影響新疆多浪羊淋巴細(xì)胞的正常生理功能。而在大于15 μmol/L的棉酚濃度下，會(huì)使新疆多浪羊淋巴細(xì)胞喪失某些生理功能，活細(xì)胞的個(gè)數(shù)減少，部分生理機(jī)能也會(huì)喪失。從總體的趨勢(shì)來看，棉酚的作用時(shí)間應(yīng)該控制在2 h以內(nèi)、濃度控制在15 μmol/L的范圍以內(nèi)，否則可能會(huì)對(duì)新疆多浪羊的生理機(jī)能產(chǎn)生一定的影響。

3 討論

Kainz等[8]提出，棉酚是一種抑制劑，不僅會(huì)抑制DNA的合成，對(duì)于RNA及蛋白質(zhì)的合成都具有明顯的抑制作用，Balakrishnan等[9]的試驗(yàn)也證明棉酚作為一種BH3類物質(zhì)，通過與抗凋亡蛋白的結(jié)合誘導(dǎo)慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的凋亡，并且也有研究證明棉酚可以引起心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張并且使溶酶體的數(shù)量增加[10]。在本試驗(yàn)中，隨著棉酚濃度的加大和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，新疆多浪羊外周血淋巴細(xì)胞的酶活力值越來越小。甲瓚類物質(zhì)的作用原理是通過MTT作用于（細(xì)胞）線粒體，采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)其酶活力的大小，可在一定程度上反映棉酚對(duì)細(xì)胞的損傷情況?？蓪⑵渥鳛樵陲曃箘?dòng)物棉子殼時(shí)的參考依據(jù)之一。棉酚也可以作為雌性動(dòng)物生殖的抑制劑，在牛的黃體細(xì)胞培養(yǎng)中，10 μg/mL的棉酚可以抑制hCG刺激的孕酮合成及cAMP合成，并且會(huì)與細(xì)胞膜相結(jié)合。大鼠體外受精卵的培養(yǎng)中，濃度為3～30 μg/mL的棉酚可以明顯降低發(fā)育到二原核期的卵細(xì)胞數(shù)，當(dāng)棉酚的濃量達(dá)到一定程度，尤其是大劑量的棉酚會(huì)擾亂雌性動(dòng)物的動(dòng)情周期，阻止受精卵的發(fā)育[11，12]，并且其著床率也會(huì)大大降低。有報(bào)道稱棉酚對(duì)卵巢內(nèi)分泌及子宮和胚胎均具有一定的毒性[13]。此外，棉酚能與蛋白質(zhì)中賴氨酸的s-氨基酸結(jié)合，可大大降低賴氨酸的有效成分，降低其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。因此本試驗(yàn)結(jié)果對(duì)于以棉子殼作為家畜主要飼料的農(nóng)牧地區(qū)具有重要的參考作用。

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