核轉(zhuǎn)染儀輔助轉(zhuǎn)染肝素酶基因siRNA有效性的實(shí)驗(yàn)研究

張彩虹?董宏偉

摘 要 目的 研究核轉(zhuǎn)染儀轉(zhuǎn)染肝素酶基因siRNA的有效性。方法 采用核轉(zhuǎn)染儀輔助轉(zhuǎn)染技術(shù)和常規(guī)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染針對(duì)肝素酶基因啟動(dòng)子區(qū)和編碼區(qū)設(shè)計(jì)siRNA，并通過(guò)實(shí)時(shí)定量RT-PCR，Western blot等技術(shù)檢測(cè)2種轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染后，肝癌細(xì)胞SMCC-7721在48h、72h和96h時(shí)肝素酶基因表達(dá)情況。結(jié)果 2種轉(zhuǎn)染技術(shù)在轉(zhuǎn)染后48h，從mRNA和蛋白水平上均能成功干擾掉肝素酶基因；但在轉(zhuǎn)染后72h，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組基因很快恢復(fù)表達(dá)，而核轉(zhuǎn)染儀轉(zhuǎn)染組基因仍保持沉默；在96h后，2組的肝素酶基因均恢復(fù)表達(dá)。結(jié)論 核轉(zhuǎn)染儀可有效轉(zhuǎn)染肝素酶基因siRNA，并使肝癌細(xì)胞SMCC-7721的肝素酶基因表達(dá)下調(diào)，且維持較長(zhǎng)時(shí)間。

關(guān)鍵詞 核轉(zhuǎn)染儀 肝素酶基因 肝癌細(xì)胞

RNA干擾（RNA interferance，RNAi）是近些年在分子生物學(xué)中迅速發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)，是基因功能研究最常用手段之一[1]；它包括轉(zhuǎn)錄水平（Transcriptional gene silencing ，TGS）和轉(zhuǎn)錄后水平（post-transcriptional gene silencing， PTGS）2種基因沉默方式[2]。通常所說(shuō)的RNAi指的是PTGS，通過(guò)基因編碼區(qū)設(shè)計(jì)的小分子RNA（siRNA）能與對(duì)應(yīng)的mRNA靶序列特異結(jié)合，并使靶序列降解，從而使基因沉默[1]。由于基因上游轉(zhuǎn)錄水平持續(xù)活躍，不停地產(chǎn)生大量mRNA，要使基因持久沉默，就得不停地給予外源性siRNA。因此，PTGS的干擾效率不高。研究發(fā)現(xiàn)植物細(xì)胞存在高效率的TGS現(xiàn)象，即在DNA水平上通過(guò)基因5端啟動(dòng)子區(qū)域DNA甲基化或組蛋白去乙?；问绞够蛴谰贸聊?；這種現(xiàn)象被稱(chēng)為siRNA指導(dǎo)下的DNA甲基化（siRNA-direct DNA methylation）或組蛋白修飾[3，4]。2004年Kawasaki 等[5]首次發(fā)現(xiàn)在人細(xì)胞也存在TGS現(xiàn)象。理論上講，一次給予針對(duì)基因5端啟動(dòng)子的siRNA，就可使該基因由于表觀遺傳修飾而保持持久沉默[6～8]。因此，TGS相對(duì)于PTGS的研究更具有經(jīng)濟(jì)性和臨床應(yīng)用前景[9]。肝素酶基因（heparanase gene，HPA）位于人染色體4q 21.3，其5端啟動(dòng)子區(qū)域含有CpG島，表明基因的表達(dá)受甲基化等表觀遺傳學(xué)機(jī)制調(diào)控[10]；HPA在肝癌、乳腺癌、大腸癌、肺癌和淋巴瘤等多種腫瘤中都有高水平的表達(dá)[11～13]，主要參與腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲。然而，TGS的沉默對(duì)象是位于細(xì)胞核中的非編碼DNA調(diào)控序列，siRNA必須進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)才能發(fā)揮作用。近年由于核轉(zhuǎn)染技術(shù)發(fā)展，尤其是德國(guó)AMAXA公司研發(fā)的NucleofectorTM專(zhuān)利創(chuàng)新技術(shù)，它采用電穿孔技術(shù)與細(xì)胞類(lèi)型特異的核轉(zhuǎn)染溶液結(jié)合方法，直接將DNA序列轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，即使是常規(guī)轉(zhuǎn)染無(wú)法轉(zhuǎn)染的原代培養(yǎng)細(xì)胞和不分裂細(xì)胞也可成功轉(zhuǎn)染，其轉(zhuǎn)染率可高達(dá)70%以上，速度快，轉(zhuǎn)染2h后就能發(fā)揮作用，操作簡(jiǎn)單方便[14，15]。但目前尚未見(jiàn)該技術(shù)用于TGS研究，既往TGS研究采用常規(guī)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)。本研究采用HPA基因?yàn)槟Ｐ停容^核轉(zhuǎn)染儀輔助轉(zhuǎn)染技術(shù)和常規(guī)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)在肝素酶基因沉默效果和沉默維持時(shí)間上的差別。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、含100 U/mL青霉素、100 U/InL鏈霉素的青鏈霉素混合液均購(gòu)自Gibco公司，SMMC-7721細(xì)胞（中科院上海細(xì)胞所），NucleofectorTM電轉(zhuǎn)試劑盒（德國(guó)Amaxa公司），德國(guó)Amaxa公司單孔核電轉(zhuǎn)儀，型號(hào)2b（北京達(dá)科維生物公司提供），Trizol試劑（invitrogen公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（fermentas公司），2×Taqmix（ABI公司），兔抗人肝素酶多克隆抗體、HPR標(biāo)記羊抗兔抗體（Santa公司），PVDF膜（ Santa 公司），發(fā)光試劑盒，Transwell小室（BD公司）；Lipofetmiane 2000試劑盒（美國(guó)Invitrogen）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮中取出SMMC-7721細(xì)胞，42℃熱水迅速?gòu)?fù)蘇，用高糖DMEM加10%的血清和1%的青鏈霉素混合液，放入37℃、5%CO2、常規(guī)濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 干擾片段設(shè)計(jì) 針對(duì)肝素酶基因啟動(dòng)子區(qū)，分別設(shè)計(jì)多個(gè)干擾片段（siRNA），在預(yù)實(shí)驗(yàn)中篩選出干擾效果較理想的siRNA；TGS的 siRNA為：GAGGAAGUGCUAGAGACUCU；同時(shí)對(duì)HPA基因編碼區(qū)設(shè)計(jì)RNAi片段：CCUUAAGAAGGCUGAUAUU（圖1），整個(gè)設(shè)計(jì)合成由美國(guó)BIOO公司協(xié)助完成，設(shè)計(jì)完成后的siRNA經(jīng)過(guò)DNAMAN軟件與原基因組BLAST以后，與肝素酶基因的啟動(dòng)區(qū)完全匹配。

1.2.3 基因轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)分為3個(gè)組，核轉(zhuǎn)染儀組，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組及對(duì)照組（不含siRNA）。在轉(zhuǎn)染前1 天，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC-7721細(xì)胞按l×106個(gè)鋪于10cm培養(yǎng)皿中，細(xì)胞生長(zhǎng)至90%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，方法按照Amaxa電轉(zhuǎn)染試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，即選擇多個(gè)參數(shù)進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化好轉(zhuǎn)染參數(shù)，將培養(yǎng)在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的106個(gè)肝癌細(xì)胞與siRNA混合，加入轉(zhuǎn)染液，重懸細(xì)胞，放入轉(zhuǎn)染杯，在電轉(zhuǎn)染儀中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。脂質(zhì)體常規(guī)轉(zhuǎn)染采用Lipofetmiane 2000試劑盒，具體操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.4 RT-PCR 分別收集轉(zhuǎn)染后48h、72h和96h的細(xì)胞，trziol一步法分別提取細(xì)胞總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)為cDNA后，PCR檢測(cè)各組細(xì)胞肝素酶基因表達(dá)情況。HPA基因上游引物：ATGTGGAGGAGAAGTTACGG，下游引物：TGAGTTGGACAGATTTGGAA；PCR條件為94℃/ 3min； 94℃ /30s；55℃/ 30s；72℃ /45s，共32個(gè)循環(huán)，最后72℃ 延伸10min。

圖1 HPA基因啟動(dòng)子siRNA設(shè)計(jì)示意圖

1.2.5 實(shí)時(shí)半定量RT-PCR HPA基因上游引物：GTGGTGATGAGGCAAGTATTC，下游引物：GTGGTGATGAGGCAAGTATTC。采用EverGreen I PCR試劑盒（Biotech）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光半定量PCR反應(yīng)，操作按說(shuō)明進(jìn)行，一管中不加模板用作陰性對(duì)照。反應(yīng)液混勻后，置于SLAN熒光定量PCR儀中。設(shè)立程序：95℃ /5min預(yù)變性后，94℃/30s， 60℃退火45s，72℃延伸45s， 循環(huán)40次，最后72℃充分延伸10min。PCR反應(yīng)結(jié)束后從55℃到95℃按每級(jí)0.5℃遞增作出溶解曲線(xiàn)，分析每個(gè)PCR反應(yīng)的溶解曲線(xiàn)以確保PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次。內(nèi)參β-actin作一相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)內(nèi)參和目的基因的Ct值計(jì)算該基因相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 Western blot檢測(cè) 將轉(zhuǎn)染后48h，72h和96h的細(xì)胞裂解，收集蛋白質(zhì)，Bradford法測(cè)定含量。蛋白變性后每孔上樣70μg，經(jīng)10%SDS一聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%脫脂牛奶封閉1h。用5%脫脂牛奶稀釋一抗（β-actin以1：2000稀釋?zhuān)每垢嗡孛缚贵w以1：500比例稀釋?zhuān)?℃搖床孵育過(guò)夜，PBST洗膜3×10 min，加入相應(yīng)的二抗（PBST1：1000稀釋?zhuān)┦覝販赜? h，PBST洗膜3×10 min，化學(xué)發(fā)光試劑檢測(cè)蛋白質(zhì)印跡，X線(xiàn)暗室曝光成像。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)半定量RT-PCR定量檢測(cè)核轉(zhuǎn)染儀和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)對(duì)基因沉默效果

定量檢測(cè)結(jié)果示：在轉(zhuǎn)染48h后，2種方法對(duì)HPA基因mRNA表達(dá)幾乎達(dá)到100%的抑制；72h后，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組HPA基因表達(dá)有所恢復(fù)，而核轉(zhuǎn)染組仍保持100%的抑制；在轉(zhuǎn)染96h后，2組HPA基因均恢復(fù)表達(dá)，表達(dá)相對(duì)量接近對(duì)照組的一半。（圖2）

2.2 Western雜交檢測(cè)核轉(zhuǎn)染組和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組對(duì)HPA基因沉默效果

western 雜交結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后48h，2組干擾細(xì)胞的HPA基因蛋白表達(dá)完全沉默；72h后，脂質(zhì)體組HPA基因蛋白再次表達(dá)，而核轉(zhuǎn)染組HPA仍保持沉默；96h后，2組細(xì)胞的HPA蛋白恢復(fù)表達(dá)（圖3）。

圖2 實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)核轉(zhuǎn)染組和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染48h、72h、96h后HPA表達(dá)情況

圖3 western blot 檢測(cè)核轉(zhuǎn)染組和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組分別在轉(zhuǎn)染后48h、72h、96h后，HPA表達(dá)情況

3 討論

惡性腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移一直是腫瘤臨床治療關(guān)鍵和難點(diǎn)，而肝素酶基因被證明在腫瘤的侵潤(rùn)轉(zhuǎn)移中起著重要作用[12]。隨著腫瘤發(fā)展分子機(jī)制闡明，腫瘤的基因治療成為目前研究重點(diǎn)之一；近年用RNAi技術(shù)在多種不同腫瘤細(xì)胞中成功干擾多種靶基因表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，已成為目前腫瘤治療研究熱點(diǎn)[1]。這些基因除腫瘤基因，還包括抗凋亡分子、端粒酶、生長(zhǎng)因子受體、某些信號(hào)分子等基因。應(yīng)用RNAi 技術(shù)，還可探索各種基因功能及相互作用，為篩選新的藥物靶基因提供便利。已有實(shí)驗(yàn)證明，通過(guò)RNAi沉默肝素酶基因，可以阻止部分腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[16]。

傳統(tǒng)的靶向腫瘤基因RNAi治療是建立在轉(zhuǎn)錄后水平上，其缺點(diǎn)是：基因的啟動(dòng)子活躍，靶基因能被持續(xù)轉(zhuǎn)錄，要想使基因長(zhǎng)期沉默，需要不間斷地給予siRNA。而目前由于用于人類(lèi)腫瘤基因治療載體存在許多問(wèn)題，建立長(zhǎng)期穩(wěn)定的特異性在瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的治療基因載體并用于臨床治療尚不成熟。用于臨床上實(shí)驗(yàn)性治療藥物多為體外合成并經(jīng)化學(xué)修飾的寡核苷酸，不僅價(jià)格昂貴，半衰期短，且有一定細(xì)胞毒性；要使靶基因沉默，需長(zhǎng)期給藥，不僅療效受到影響，毒性很大，也不經(jīng)濟(jì)。而轉(zhuǎn)錄水平的RNAi不僅誘導(dǎo)基因調(diào)控序列同源靶序列被降解，還可以誘導(dǎo)異染色質(zhì)形成，DNA甲基化，組蛋白修飾等表觀遺傳學(xué)改變，使基因不能轉(zhuǎn)錄；理論上講，一次給予針對(duì)5端啟動(dòng)子的siRNA就可使該基因永久沉默，因此對(duì)于轉(zhuǎn)錄水平的RNA干擾，有著更廣泛地應(yīng)用前景[9]。要實(shí)現(xiàn)TGS， 必須要將siRNA有效轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，本項(xiàng)研究是通過(guò)核轉(zhuǎn)染儀將設(shè)計(jì)在肝素酶5端的siRNA轉(zhuǎn)入肝癌細(xì)胞，以證實(shí)轉(zhuǎn)錄水平干擾的優(yōu)越性。

研究首先針對(duì)細(xì)胞核內(nèi)的啟動(dòng)子區(qū)，設(shè)計(jì)siRNA靶點(diǎn)，同時(shí)對(duì)胞漿內(nèi)的mRNA區(qū)設(shè)計(jì)相應(yīng)siRNA靶點(diǎn)，通過(guò)PCR初步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，2組細(xì)胞在干擾發(fā)生48h后，基因同時(shí)都被沉默；72h時(shí)，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞基因沉默效果明顯下降，而核轉(zhuǎn)染組細(xì)胞基因沉默效果仍然很明顯，96h時(shí)，2組細(xì)胞的肝素酶基因再次同時(shí)表達(dá)出來(lái)，RT-PCR證實(shí)這個(gè)結(jié)果。從Western blot實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證明，核轉(zhuǎn)染技術(shù)的轉(zhuǎn)錄水平沉默肝素酶基因比脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)錄水平沉默肝素酶基因細(xì)胞，肝素酶的沉默時(shí)間維持更長(zhǎng)些；但是96h的時(shí)候，2組肝素酶蛋白又再次表達(dá)。相對(duì)于脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)錄后基因沉默，核轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默維持時(shí)間相對(duì)更持久，但并未達(dá)到先前預(yù)期的基因永久沉默目的。

盡管本次實(shí)驗(yàn)從基因水平和蛋白水平都無(wú)法證實(shí)，TGS對(duì)基因有著永久沉默作用；但是相比于PTGS，TGS對(duì)基因沉默維持時(shí)間顯然有所延長(zhǎng)。上述結(jié)果與理論上轉(zhuǎn)錄水平干擾能持久沉默基因的推測(cè)仍然有較大差距，其原因可能有：（1）細(xì)胞核轉(zhuǎn)染的效率；電轉(zhuǎn)染只有一少部分siRNA被轉(zhuǎn)染進(jìn)核中，多數(shù)siRNA還是留在胞漿內(nèi)被降解，可能會(huì)造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果不理想。在實(shí)驗(yàn)中，用普通的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HPA調(diào)控區(qū)siRNA，TGS幾乎無(wú)任何基因沉默作用，而轉(zhuǎn)染編碼區(qū)siRNA， PTGS卻有明顯基因沉默效應(yīng)（結(jié)果未公布），說(shuō)明TGS必須用有效的核轉(zhuǎn)染技術(shù)。（2）不同細(xì)胞或基因?qū)GS的效果不同?？赡懿煌?xì)胞或基因表達(dá)調(diào)控受多種機(jī)制影響，表觀遺傳學(xué)因素只是其中一種。（3）表觀遺傳學(xué)控制基因的表達(dá)是可逆的。

雖然如此，本實(shí)驗(yàn)為T(mén)GS在腫瘤基因治療中的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，至于TGS的作用機(jī)制，以及是否針對(duì)CpG島或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的RNAi更有效，一次RNAi導(dǎo)致的表遺傳學(xué)改變能維持多長(zhǎng)時(shí)間（細(xì)胞能傳多少代），是否含有CpG島的基因更適合針對(duì)啟動(dòng)子的RNAi等等，則需要更多實(shí)驗(yàn)加以論證。

參考文獻(xiàn)

[1] Davidson BL， McCray PB Jr. Current prospects for RNA interference-based thereapies. Nat Rev Genet 2011，12（5）：329-340.

[2] Verdel A， Vavasseur A， Le Gorrec M， et al. Common themes in siRNA-mediated epigenetic silencing pathway. Int J Dev Biol 2009，53（2-3）：245-257.

[3] MOrris KV， et al. Small interfering RNA-induced transcriptional gene silencing in human cells. Science 2004，305（5688）：1289-1292.

[4] Kurth HM， Mochizuki K. Non-coding RNA： a bridge between small RNA and DNA. RNA Biol 2009，6（2）：138-140.

[5] Kawasaki H， et al. Induction of DNA methylation and gene silencing by short interfering RNAs in human cells. Nature； 2004，431（7005）：211-217.

[6] Weinberg MS， et al. The antisense strand of small interfering RNAs directs histone methylation and transcriptional gene silencing in human cells. RNA 2006，12（2）：256-262.

[7] Swanten C， et al. RNA interference， DNA methylation， and gene silencing： a bright future for cancer therapy？ Lancet Oncology 2004，5：653-654.

[8] Castanotto D， et al. Short RNA-directed cytosine （CpG） methylation of RASSF1A gene promoter in HeLa cell. Mol Ther 2005，12（1）：179-183.

[9] Morris KV. RNA-mediated transcriptional gene silencing in human cells. Curr TOP Microbiol Immunol 2008，320：211-224.

[10] Jiang P， et al. Cloning and characterization of the humanheparanase-1（HPR1） gene promoter. J Biological Chemistry 2002，277（11）：8989-8998.

[11] Zcharia E ， Metzgers ， Chajek- shaul T ， et al . Molecular properties and involvement of heparanase in cancer progression and mammary gland morphogenesis. J . Mammary Gland Biol Neoplasia ， 2001，6 （3） ：311-322.

[12] Friedmann Y， Vlodavsky I ， Aingorn H ， et al . Expression of heparanase in normal ， dysplastic and neoplastic human colon mucosa and stroma. Evidence for its role in colonic tumorigenesis. J . Am J pathol ， 2000，157（4） ：1167-1175.

[13] El2Assal ON ， Yamanoi A ， Ono T ， et al . The clinicpathological significance of heparanase and expressions in heptatocellulor carcinoma J . Clincancer Res ， 2001 ，7 （5） ：1299-1305.

[14] Doherty JE， Huye LE， Yusa K， et al. Hyperactive piggyBac Gene Transfer in Human Cells and In Vivo. Hum Gene Ther 2012，23（3）：311-320.

[15] Wagner W， McCroskery S， Hammer JA， et al. An efficient method for the long-term and specific expression of exogenous cDNAs in cultured Purkinje neurons. J Neurosci Methods 2011，（2）：95-105.

[16] Yingying X， Yong Z， Zhenning W， et al. Role of heparanase-1 in gastric carcinoma invasion. Asian Pac J Cancer Prev 2009，10（1）：151-154.