血管緊張素II對骨髓間充質(zhì)干細胞定向誘導(dǎo)為角質(zhì)形成細胞調(diào)控作用的實驗研究

徐媛　劉宏偉　程飚等

[摘要]目的：探討骨髓間充質(zhì)干細胞（MSCs）分化為角質(zhì)形成細胞的可能性及在此過程中血管緊張素II（AngII）對其的調(diào)控作用。方法：抽取Wistar大鼠的骨髓，經(jīng)全骨髓法分離、純化MSCs，鑒定后建立MSCs細胞模型，用成膠質(zhì)細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)其為角質(zhì)形成細胞，顯微鏡下觀察其形態(tài)學(xué)變化。以添加了AngII的成角質(zhì)形成細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基組與單純成角質(zhì)形成細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基組在誘導(dǎo)MSCs 7天、10天后行角蛋白10（CKP10） 免疫組織化學(xué)染色及流式細胞儀檢測，并進行對比觀察分析。結(jié)果：培養(yǎng)的MSCs具有成脂、成骨分化的能力。MSCs可以成功誘導(dǎo)為角質(zhì)形成細胞，添加AngII的誘導(dǎo)組與對照誘導(dǎo)組CKP10免疫組化染色均有陽性表達，但添加AngII組陽性細胞數(shù)高于對照組。流式細胞儀檢測顯示CKP10陽性細胞百分率，AngII組為80.62%，對照組（32.46%），兩者相差顯著（P<0.05）。結(jié)論：MSCs可以誘導(dǎo)分化為角質(zhì)形成細胞，ANGII對MSC的成角質(zhì)形成細胞分化有顯著的促進作用，這一作用可能是AngII促進創(chuàng)面愈合的機制之一。

[關(guān)鍵詞]骨髓間充質(zhì)干細胞；角質(zhì)形成細胞；創(chuàng)面愈合

[中圖分類號]Q813.1 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2013）07-0739-04

眾所周知，干細胞在創(chuàng)面修復(fù)中起到了重要的作用，其為創(chuàng)面愈合提供了各種組織細胞。業(yè)已證明，成體骨髓來源的間充質(zhì)干細胞（MSCs） 具有多向分化潛能，可作為組織工程中多種種子細胞。關(guān)于MSCs分化為多種組織細胞的在體或離體實驗研究，國內(nèi)外已多見報道[1-6]。但MSCs體外培養(yǎng)分化為上皮細胞相關(guān)報道較少，其過程中各種調(diào)控因素尚不清楚。許多實驗以及臨床現(xiàn)象已經(jīng)證明，腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）對促進創(chuàng)面愈合起了積極重要的作用。為了探討MSCs是否能體外誘導(dǎo)分化為上皮細胞以及在這一過程中RAS所起的調(diào)控作用，筆者以Wistar大鼠為實驗對象，體外培養(yǎng)其MSCs，觀察 MSCs是否可分化為上皮細胞以及在這一過程中血管緊張素II（ANGII）所起到的調(diào)控作用。

1 材料和方法

1.1 MSCs的體外培養(yǎng)與鑒定：采用10～12周雄性Wistar大鼠（中山大學(xué)實驗動物中心提供），大鼠頸椎脫臼處死，無菌條件下分離雙下肢，低糖DMEM培養(yǎng)液從雙側(cè)脛骨及腓骨沖出骨髓，50目網(wǎng)篩慮過骨渣，離心棄上清液，以含體積分數(shù)10%的胎牛血清青霉素（100U/ml）和鏈霉素（100μg/ml）的DMEM/ F12培養(yǎng)液重懸沉淀，1×109/L密度接種，于37℃、體積分數(shù)為5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h首次半量換液，以后每3 天全量換液一次。按1∶3傳代培養(yǎng)，接近融合的MSCs用質(zhì)量濃度0.25%的胰蛋白酶（美國 Sigma公司）室溫消化30s～1min。取第3代MSCs進行實驗。取生長良好的第3代BMSCs，以2×104/ml的細胞密度接種于孔板中，分別加入成骨分化及脂向分化誘導(dǎo)液，觀察誘導(dǎo)情況。用ALP染色及油紅0染色鑒定MSCs多向分化能力。同時用流式細胞儀檢測MSCs的CD29、CD45、CD71、CD90的陽性率。

1.2 成上皮誘導(dǎo)：取第3代MSCs按上訴濃度接種于孔板中，用成上皮誘導(dǎo)液進行培養(yǎng)，每3天全量換液一次。成上皮誘導(dǎo)液配置為含體積分數(shù)10%的胎牛血清青霉素（100U/ml） 和鏈霉素（100μg/ml）的DMEM/F12培養(yǎng)液中加入0.5nM骨形成蛋白-4（BMP-4） （R&D Systems），0.3mM抗壞血酸，3 ng/ml人表皮生長因子。于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化。

1.3 ANG II調(diào)控成上皮誘導(dǎo)：取第3代MSCs按上訴濃度接種于孔板中，分別設(shè)置對照組與實驗組，對照組按上述成上皮誘導(dǎo)方案進行誘導(dǎo)，實驗組在原有成上皮誘導(dǎo)液內(nèi)加入1×10-7mol/L的ANG II。兩組細胞均培養(yǎng)于37℃、體積分數(shù)為5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中，每3天全量換各自誘導(dǎo)液一次。

1.4 免疫細胞化學(xué)染色：分別在對照組與實驗組細胞誘導(dǎo)7天及10天后，PBS洗去培養(yǎng)基，5%多聚甲醛固定，嚴格按照Maxim生物技術(shù)有限公司提供的免疫組化染色試劑盒說明書操作。氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色。角蛋白10（CKP10）多克隆抗體（Maxim）工作濃度1：100。蘇木精復(fù)染.以非特異血清代替抗作為陰性對照。角蛋白陽性細胞胞漿呈棕黃色。

1.5 流式細胞儀檢測：分別在對照組與實驗組細胞誘導(dǎo)3天及7天后，PBS洗去培養(yǎng)基，0.25%的胰蛋白酶消化后收集細。CKP10多克隆抗體（Maxim）工作濃度l：20，4℃孵育30min。PBS洗滌3次，加入異硫氰酸熒光素（FITC）標記的羊抗鼠二抗（Sigma）工作濃度l：200，4℃孵育30min。PBS洗滌3次后，流式細胞儀（BectonDickinson）檢測。

2 結(jié)果

2.1 MSCs體外培養(yǎng)與鑒定：原代MSCs經(jīng)24h體外培養(yǎng)，見少量貼壁細胞。貼壁細胞前2～3天生長緩慢，以后迅速增殖，呈克隆樣生長，細胞呈較均一的梭形，7～10天匯合，細胞呈比較均一的梭形（圖1）。BMSCs 經(jīng)骨向誘導(dǎo)后第6天呈三角形或多角形。第8天，細胞外基質(zhì)分泌增多，胞漿中及胞質(zhì)外可見較多黑色顆粒，胞核色淡，胞漿色深。第21天，細胞聚集成多個散在結(jié)節(jié)，中心呈黑色致密團塊狀。鈣鈷法染色檢測 ALP 活性呈陽性，胞漿內(nèi)見深黑色顆粒（圖2）。MSCs 經(jīng)成脂誘導(dǎo)后第5天可見胞漿內(nèi)黃色折旋旋光性小脂滴。隨時間推移，小脂滴增多融合成大脂滴，細胞核被脂滴擠于一側(cè)。10天油紅0染色示脂滴呈紅色（圖3）。同時，第3代 BMSCs表面CD29、CD90檢測陽性，CD45、CD71檢測陰性（圖4）。

2.2 MSCs誘導(dǎo)為上皮細胞已經(jīng)ANGII在其中的調(diào)控作用：BMSCs經(jīng)成上皮誘導(dǎo)后3天開始，部分細胞梭形形態(tài)發(fā)生變態(tài)，圍繞細胞核成圓餅形，細胞質(zhì)減少，細胞核所占細胞整體比例明顯增大，細胞核有突起，呈典型上皮樣細胞形態(tài)。誘導(dǎo)后7天時，兩組細胞角蛋白10（CKP10）染色均成陽性，但實驗組陽性細胞數(shù)明顯多于對照組。誘導(dǎo)后10天CKP10染色，該現(xiàn)象更為明顯（圖5）。流式細胞儀檢測，同等誘導(dǎo)時間下，實驗組MSCs誘導(dǎo)為上皮細胞誘導(dǎo)率明顯高于對照組（圖6）。

3 討論

創(chuàng)傷后，機體除調(diào)動創(chuàng)傷局部組織的細胞直接參與修復(fù)以恢復(fù)受損組織的完整性外，還通過動員骨髓來源的干細胞向受損組織遷移，其在創(chuàng)面分化為創(chuàng)傷修復(fù)所需細胞來促進創(chuàng)面愈合。MSCs來源于中胚層，具跨胚層分化潛能，F(xiàn)riedenstein等（1974）把骨髓來源的成纖維細胞移植到腎包膜下，可以誘導(dǎo)形成骨和骨髓；體內(nèi)外許多實驗表明MSCs有很大的可塑性，當把MSCs移植到非放射損傷宿主，MSCs可以分化為非造血組織細胞，包括肌肉、軟 骨、骨、肝、心臟、腦、腸及肺等[7-9]。胚胎發(fā)育中存在一系列上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換，原始間充質(zhì)細胞始于內(nèi)細胞團，是首次上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換，形成新的組織器官需從間充質(zhì)向上皮轉(zhuǎn)換，反之亦然。關(guān)于MSCs誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為上皮細胞的研究，國內(nèi)外文獻較少報道。木有已有的研究表明，支持MSCs能在特定條件下跨胚層誘導(dǎo)為上皮細胞，但誘導(dǎo)方案五花八門，誘導(dǎo)效能也各有高低[10]。在本試驗中，筆者將BMP-4、抗壞血酸以及人表皮生長因子加入常規(guī)培養(yǎng)基中，成功將MSCs誘導(dǎo)為上皮細胞，誘導(dǎo)成功率高。這一現(xiàn)象，提示在創(chuàng)面愈合過程中，MSCs有可能可以向上皮細胞轉(zhuǎn)化，為創(chuàng)面修復(fù)提供修復(fù)細胞，從而促進創(chuàng)面愈合。

雖然現(xiàn)有研究均指向MSCs能誘導(dǎo)分化為上皮細胞，但這一過程的調(diào)控因素及機制尚不明確。而由于MSCs的易獲得性、多能性以及低免疫原性，奠定了其作為再生醫(yī)學(xué)研究的重要靶細胞，并使人們看到了其臨床應(yīng)用的實際可能。因此，闡明MSCs向上皮細胞分化中的調(diào)控因素對于再生醫(yī)學(xué)的臨床轉(zhuǎn)化有著重要的意義。

腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）是調(diào)節(jié)機體功能的重要激素系統(tǒng)之一。它不僅在調(diào)節(jié)血壓以及水電解質(zhì)平衡方面起到重要作用，而且還在心、腦、肺和血管等組織器官的損傷修復(fù)中扮演重要的角色。最近的研究發(fā)現(xiàn)：RAS在皮膚損傷修復(fù)與再生過程中也起到非常重要的作用[11-12]，本實驗亦證明了RAS在MSCs中的存在。而ANGII作為RAS中的重要活性物質(zhì)，是否對MSCs誘導(dǎo)為上皮細胞這一過程進行干預(yù)，引起了筆者的關(guān)注。由本實驗結(jié)果可以看出，添加ANGII組的上皮細胞轉(zhuǎn)化率明顯高于對照組，提高了誘導(dǎo)成功的可能性。一方面，機體內(nèi)MSCs數(shù)量有限，若想獲得足夠數(shù)量的移植細胞，需經(jīng)歷較長的體外擴增階段。如果在擴增階段對MSCs給予相當?shù)恼T導(dǎo)，能在一定程度上消除細胞分化時的不穩(wěn)定性，指引其像上皮細胞分化。另一方面，在提供創(chuàng)面床ANGII含量，有助于已經(jīng)移行至創(chuàng)面的MSCs高效的分化為上皮細胞，積極的參與到創(chuàng)面修復(fù)中來促進創(chuàng)面愈合。

MSCs向上皮細胞分化是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，可能涉及多種信號通路的調(diào)控。通過上述實驗結(jié)果，我們可以初步斷定，ANGII對MSCs向上皮細胞轉(zhuǎn)化有促進調(diào)節(jié)作用，而其調(diào)控實現(xiàn)機制有待于進一步的實驗來證明。相信隨著研究的進一步深入，MSCs轉(zhuǎn)化為上皮細胞從而促進創(chuàng)面愈合這一過程將清晰的展示在我們面前，并將為火熱的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)事業(yè)添磚加瓦。

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[收稿日期]2013-01-11 [修回日期]2013-03-22

編輯/張惠娟