刺五加中刺五加總苷的大孔樹脂工藝精制研究

汪春泉 莫永俊等

摘 要：目的：篩選刺五加總苷的大孔樹脂純化工藝。方法：以紫丁香苷為對照，采用分光光度法，通過刺五加總苷對5種大孔樹脂的靜態(tài)吸附及解析效果考察，篩選出適合純化刺五加總苷的大孔樹脂，進(jìn)而通過動(dòng)態(tài)吸附及解析的條件對純化刺五加總苷的工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果：D-101型大孔樹脂適合純化刺五加總苷，優(yōu)化后的最佳富集工藝條件為：上樣液質(zhì)量濃度為0.3 g·ml-1，上樣量為50 ml/10 g樹脂，依次用7倍樹脂體積量水及75%乙醇進(jìn)行洗脫，濃縮干燥乙醇洗脫液，得刺五加總苷。刺五加總苷轉(zhuǎn)移率達(dá)60%以上。結(jié)論：本方法適合刺五加總苷的富集。

關(guān)鍵詞：刺五加 刺五加總苷 大孔吸附樹脂 工藝優(yōu)化

中圖分類號(hào)：R284 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-3791（2013）03（b）-0226-02

刺五加為五加科植物刺五加Acnthopanax senticosus （Rupr.et Maxim.） Harms的干燥根及根莖，又名五加參、刺拐棒，具有扶正固本、補(bǔ)腎安寧之功效[1]。刺五加中含紫丁香苷，刺五加苷D和異秦皮啶等酚苷類物質(zhì)。藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，刺五加具有抗心肌缺血[2]，抗疲勞[3]，改善老年癡呆及帕金森氏癥[4～6]等作用，其主要有效組分為刺五加總苷。本實(shí)驗(yàn)以刺五加總苷為考察指標(biāo)，采用大孔吸附樹脂法對其進(jìn)行富集，確定刺五加總苷的最佳富集條件。

目前有關(guān)于應(yīng)用大孔吸附樹脂富集刺五加總苷的報(bào)道中，終產(chǎn)品有效物質(zhì)含量都不足20%[7]，本研究希望對此有所改進(jìn)。

1 儀器與試藥

W-2102 PC型紫外可見分光光度計(jì)（上海尤尼柯儀器有限公司）；LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津公司）；KQ-250B型超聲波震蕩提取器（昆山市儀器有限公司）。

刺五加生藥購自當(dāng)?shù)啬乘幍辏óa(chǎn)地：吉林，批號(hào)：D0201），由北京藥植所趙曉宏副研究員鑒定為五加科植物刺五加Acnthopanax senticosus （Rupr.et Maxim.） Harms的干燥根及根莖；紫丁香苷（純度≥98%，成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)：MUST-11082414），甲醇、乙醇（分析醇），RO反滲透水，D-101型，D-201型，AB-8型，ADS-7型，S-8型大孔樹脂購自滄州寶恩吸附材料科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 刺五加總苷含量測定方法[8]

2.1.1 測定波長的選擇

配制一定濃度的紫丁香苷對照品溶液，在190 nm～1100 nm進(jìn)行全波長掃描，在265 nm處有最大吸收，因此確定265 nm為測定波長。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

精密稱取紫丁香苷標(biāo)準(zhǔn)品2.51 mg，用甲醇定容于50 ml容量瓶中，配制成濃度為50.2 μg·ml-1的對照品溶液，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，備用。

2.1.3 上柱樣品液的配制

取刺五加生藥材粗粉2 kg，加入10倍量濃度為60%的乙醇溶液，80 ℃熱回流提取2次，每次1 h，合并提取液，過濾，濃縮至干，制成干膏。上樣時(shí)加入不同體積的溶劑配制成濃度適宜的上柱樣品液。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別精密吸取對照品溶液1 ml，1.5 ml， 2 ml，2.5 ml，3 ml，3.5 ml于10 ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得系列對照品溶液。以甲醇為空白，在265 nm處測定吸光度，以紫丁香苷濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=0.047X-0.003，r2=0.9999，結(jié)果表明紫丁香苷在5～17 μg·ml-1范圍線性良好。

2.1.5 樣品測定

精密秤取刺五加干膏0.13 g，用甲醇定容于25 ml容量瓶中，過濾，取濾液，以甲醇為空白，在265 nm處測定吸光度，帶入回歸方程，經(jīng)計(jì)算提取物中刺五加總苷含量為13.0%。

2.2 不同型號(hào)大孔吸附樹脂的篩選[9]

2.2.1 靜態(tài)吸附性能考察

精密取5份刺五加干膏0.340 g，分別置250 ml具塞錐形瓶中，加入50 ml水使之充分溶解，順次加入2.000 g已處理好的5種不同樹脂，20 °C恒溫振搖24 h，轉(zhuǎn)速130 r·min-1，使之飽和吸附，將濾液濃縮至干，在265 nm處測定吸光度，按以下公式計(jì)算不同型號(hào)的大孔吸附樹脂對于刺五加總苷的吸附率：吸附率%=（吸附前上柱樣品液中刺五加總苷量-吸附后濾液中刺五加總苷量）/吸附前上柱樣品液中刺五加總苷量×100%，平行做3次，平均吸附率分別為：D-101：91.17%； D-201：85.21%；AB-8：94.80%；ADS-7：93.98%；S-8：94.80%。

2.2.2 靜態(tài)解析性能考察

吸附刺五加總苷的樹脂用水洗至Molish反應(yīng)為陰性，吸干樹脂表面水分后，分別加入20 ml95%乙醇，20 °C恒溫振搖4 h，轉(zhuǎn)速130 r·min-1。過濾，將濾液濃縮至干，測定紫丁香苷相對含量，并在265 nm處測定吸光度，按以下公式計(jì)算不同型號(hào)的大孔樹脂對刺五加總苷的解析率：解析率%=解析的刺五加總苷量/（吸附前上柱樣品液中刺五加總苷量-吸附后流出液中刺五加總苷量）×100%，結(jié)果見表1。

由以上可知，D-201型大孔樹脂對刺五加總苷的靜態(tài)吸附量較小，并且解析效果不好，而其他4種型號(hào)大孔樹脂對刺五加總苷的吸附量均較好。ADS-7和S-8兩種型號(hào)的大孔樹脂吸附刺五加總苷的能力極佳，但是很難洗脫。對于剩余兩種型號(hào)的大孔樹脂D-101和AB-8來講，AB-8的吸附能力要稍好于D-101，但是解析刺五加總苷的能力卻稍顯遜色，解析率要低于D-101。綜合考慮，選用D-101型大孔樹脂分離純化刺五加提取物。

2.3 D-101型大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附及解析條件優(yōu)化

2.3.1 最佳上柱樣品液濃度的考察

精密取2.540 g干膏5份，分別加入400 ml、200 ml、135 ml、100 ml、67 ml水，配制成刺五加總苷濃度為0.85 mg·ml-1，1.65 mg·ml-1，2.45 mg·ml-1，3.25 mg·ml-1，4.85 mg·ml-1的上柱樣品液，分別以1 ml·min-1的流速通過裝有10gD-101型大孔樹脂的層析柱，進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，結(jié)合Molish反應(yīng)用水洗至糖的反應(yīng)為陰性，再分別用10倍樹脂體積（10 BV，下同）濃度為95%乙醇以1 ml·min-1洗脫，收集乙醇洗脫液，濃縮至干，測定總苷含量并計(jì)算解析率，結(jié)果見表2。

結(jié)果表明，當(dāng)上柱樣品液的刺五加總苷濃度為2.45 mg·ml-1時(shí)，洗脫下來的總苷含量及解析率均為最高，故采用2.45 g·ml-1為最佳上柱樣品液濃度。

2.3.2 最大上樣量的考察

精密配制刺五加總苷濃度為2.45 mg·ml-1上柱樣品液100 ml，以1 ml·min-1的流速通過裝有10 gD-101型大孔吸附樹脂的層析柱，進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，以1 BV為一個(gè)流分接取上樣后的流出液，連續(xù)接取10組，濃縮至干，測定刺五加總苷含量。以每份流出液體積為橫坐標(biāo)，流出液中刺五加總苷含量為縱坐標(biāo)，繪制泄漏曲線，結(jié)果見表3。

根據(jù)泄漏曲線可知，當(dāng)上柱樣品液達(dá)到5 BV時(shí)刺五加總苷開始明顯泄漏。設(shè)定刺五加總苷未吸附率10%為泄漏點(diǎn)，據(jù)此確定最大上柱樣品液的體積為50 ml，相當(dāng)于最大上樣量以刺五加總苷含量計(jì)為12.34 mg·g-1樹脂。

2.3.3 水洗量的考察

精密配制刺五加總苷濃度為2.45 mg·ml-1的刺五加上樣液50 ml，以1 ml·min-1的流速通過裝有10 gD-101型大孔樹脂的層析柱，進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，然后水洗，以每1 BV為一個(gè)流分連續(xù)接取水洗流出液，用Molish反應(yīng)進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，水洗至7 BV時(shí)，水溶性雜質(zhì)基本全部被洗出，故確定7 BV蒸餾水為洗脫終點(diǎn)。

2.3.4 洗脫劑濃度的考察

精密配制刺五加總苷濃度為2.45 mg·ml-1的刺五加上樣液50 ml，以1 ml·min-1的流速通過裝有10 gD-101型大孔樹脂的層析柱，進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，用7 BV蒸餾水水洗至糖的反應(yīng)為陰性，再依次加入10 BV15%，35%，55%，75%，95%乙醇以1 ml·min-1分次洗脫，收集各段洗出液，濃縮至干，測定刺五加總苷含量，結(jié)果見表4。

結(jié)果表明，濃度為75%的乙醇可以將98%以上的刺五加總苷洗脫下來，故確定以濃度為75%的乙醇作為洗脫劑較為合適。

2.3.5 洗脫曲線的考察

精密配制刺五加總苷濃度為2.45 mg·ml-1的刺五加上樣液50 ml，以1 ml·min-1的流速通過裝有10 gD-101型大孔吸附樹脂的層析柱，進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，用7 BV蒸餾水水洗至糖的反應(yīng)為陰性，再加入10 BV75%乙醇以1 ml·min-1進(jìn)行動(dòng)態(tài)洗脫，以每1 BV為一個(gè)流分，連續(xù)接取10組，收集每組的洗脫液，濃縮至干，測定刺五加總苷含量，結(jié)果見表5。

結(jié)果表明，前7BV75%乙醇可將99%的刺五加總苷解吸下來，故確定以7BV為洗脫劑用量。

2.3.6 大孔吸附樹脂工藝的確定

通過上述研究確定D-101型大孔樹脂富集刺五加總苷的工藝為：精密配制刺五加總苷濃度為2.45 mg·ml-1上柱樣品液50 ml，以1 ml·min-1緩慢通過預(yù)處理的D-101型大孔樹脂樹脂柱，用7 BV蒸餾水以1 ml·min-1沖洗，棄去水洗脫液，繼用7 BV75%乙醇以1 ml·min-1洗脫，收集乙醇洗脫液，減壓濃縮至干，即得刺五加提取物。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

分別精確配制刺五加總苷濃度為2.45 mg·ml-1的上柱樣品液，按照2.3.6方法進(jìn)行試驗(yàn)。重復(fù)3次，得刺五加總苷含量及有效成分的回收率。結(jié)果見表6。

2.5 中試實(shí)驗(yàn)

將本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)大40倍生產(chǎn)，所得終產(chǎn)品中刺五加總苷含量為24.24%，紫丁香苷相對含量為0.97%，工藝比較穩(wěn)定。

3 討論

針對本研究的大孔吸附樹脂再生，作者建議先用濃度為25%～30%乙醇洗至流出液澄清，再用濃度為90%～95%乙醇洗脫，后采用5%稀HCl和5%NaoH洗脫，其間用水洗至pH值為中性，可達(dá)到很好的再生效果。

大孔樹脂法成本低、易操作、效率高得特點(diǎn)，近年來得到廣泛應(yīng)用。通過此方法，本實(shí)驗(yàn)刺五加終產(chǎn)品中刺五加總苷含量可達(dá)到20%以上，且紫丁香苷相對含量為0.9%，工藝放大后較為穩(wěn)定，此方法值得深入研究，為以后研究大孔吸附樹脂富集其苷類有效成分打下基礎(chǔ)。

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