白菜SSR分子標(biāo)記的研究進展

張婉 李麗

摘 要：簡述了SSR分子標(biāo)記的基本原理和特點，從白菜種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、SRR指紋圖譜的構(gòu)建、雜交種純度的鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建和分子標(biāo)記在輔助育種上的應(yīng)用等幾個方面介紹了近年來白菜研究中SSR分子標(biāo)記的研究進展及應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：白菜；分子標(biāo)記；SSR；遺傳分析

引言

白菜（Brassica campestris L. ssp. Pekinensis）原產(chǎn)于我國北方，現(xiàn)廣泛種植于全國的標(biāo)志性蔬菜種類之一，分為結(jié)球白菜、不結(jié)球白菜兩個亞種。由于不同的白菜品種之間可以進行天然的雜交，如隔離不當(dāng)以至于品種之間混淆，形成了很多栽培亞種或變種，且現(xiàn)今大量的白菜新品種涌入市場，因此，品種差異的鑒定在蔬菜生產(chǎn)和使用中顯得尤為重要。對于商用種子的品種鑒別，新品種登記測試以及資源種質(zhì)遺傳多樣性分析，都非常需要發(fā)展一種高效、快速、準(zhǔn)確和經(jīng)濟實用的品種鑒別方式[1]。近年來生化和分子標(biāo)記技術(shù)的快速發(fā)展使得其在鑒別能力、速度及準(zhǔn)確性方面都比傳統(tǒng)的種植鑒別有明顯的優(yōu)勢，并且這些技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于茄子、黃瓜、玉米、水稻等蔬菜作物種質(zhì)資源的鑒定，指紋圖譜的構(gòu)建，分子標(biāo)記輔助選擇育種及雜交種純度的檢測。利用分子技術(shù)已經(jīng)在白菜的研究中進行了遺傳多樣性的分析，SSR指紋圖譜的構(gòu)建，品種真實性的鑒定及純度的檢測等大量工作[2-4]。在新品種審定及新品種的品種權(quán)授予前需要進行DUS測試，確定該品種的特異性（Distinctness）、一致性（Uniformity）和穩(wěn)定性（Stability） ，由于在各項研究中運用了分子標(biāo)記技術(shù)，大大減少了實際中對于白菜種子檢測的工作量。

現(xiàn)階段在蔬菜研究中應(yīng)用較廣泛的DNA分子標(biāo)記主要包括擴增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）、隨機擴增的多態(tài)性 （random amplified polymorphic DNA，RAPD）、相關(guān)序列擴增多態(tài)性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）、簡單重復(fù)序列區(qū)間擴增多態(tài)性（ simple sequence repeats，SSR）。AFLP標(biāo)記技術(shù)是基于PCR擴增基因組DNA限制性片段，目前在甘藍(lán)、大白菜、番茄、馬鈴薯、黃瓜等蔬菜作物的品種純度鑒定上得以應(yīng)用，但由于其操作程序較復(fù)雜，成本較高，影響其在商業(yè)品種鑒定中的廣泛使用。RAPD技術(shù)自建立以來就在蔬菜研究中得到廣泛的應(yīng)用[5]，然而對于栽培品種之間真實性鑒別，其多態(tài)性頻率相對較低，實驗重復(fù)性較差，影響其在品種鑒定中廣泛應(yīng)用。SRAP是一種新型的基于PCR的標(biāo)記系統(tǒng)，最早是在蕓薹屬作物開發(fā)出來。SSR分子標(biāo)記技術(shù)通過設(shè)計引物進行SSR的多態(tài)性分析的方法已在植物中得到較廣泛的應(yīng)用。本文對于應(yīng)用較廣泛的SSR分子標(biāo)記技術(shù)在白菜品種鑒定中的研究及應(yīng)用現(xiàn)狀進行了概述，為今后的白菜研究工作提供一定的參考。

1 SSR分子標(biāo)記的基本原理和特點

SSR也叫微衛(wèi)星DNA，一般由幾個核苷酸（2-5bp）序列簡單串聯(lián)成重復(fù)序列，根據(jù)微衛(wèi)星序列兩端的保守序列設(shè)計特異性引物，通過PCR反應(yīng)擴增，并將擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測得到的擴增片段，從而來揭示其多態(tài)性。SSR具有以下幾個特點：（1）一般檢測到的是一個單一的多等位基因位點；（2）呈共顯性遺傳，可用來對雜交種進行純度檢測；（3）實驗所需DNA量較少，且操作簡單，實驗重復(fù)性好，結(jié)果可靠性高；（4）數(shù)量豐富，且均勻覆蓋整個染色體組。與其他分子標(biāo)記技術(shù)相比，SSR標(biāo)記在遺傳多樣性分析和品種鑒定上的優(yōu)勢顯而易見，重要的是可以選特定的染色體上特定位置的SSR標(biāo)記進行種質(zhì)資源的鑒定和雜交種純度的檢測。

2 白菜種質(zhì)資源遺傳多樣性的分析

分子標(biāo)記在種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究中是一種有效的技術(shù)手段，目前，主要應(yīng)用在遺傳多樣性分析中的分子標(biāo)記技術(shù)有AFLP、ISSR和SSR標(biāo)記等[6-7]，其中SSR標(biāo)記以其豐富的多態(tài)性被廣泛應(yīng)用于蔬菜作物品種的遺傳多樣性的分析中。楊華[8]等利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，對17份甘藍(lán)、44份白菜，共61份蕓薹屬蔬菜進行遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示，所有材料被分為甘藍(lán)和白菜兩大類，其中白菜類品種的遺傳相似系數(shù)在0.96～0.77之間，甘藍(lán)類品種相似系數(shù)在0.93～0.63之間。并且作者還通過SSR分子標(biāo)記技術(shù)與農(nóng)藝性狀鑒定相結(jié)合的方法來進行蕓薹屬蔬菜的多樣性的分析，彌補了單一農(nóng)藝性狀鑒定上的不足之處，使之更加準(zhǔn)確可靠。另外，在ISSR標(biāo)記分析遺傳多樣性方面，杜黎明[9]等利用ISSR分子標(biāo)記法，用11個具有高多態(tài)性引物對65個白菜樣品進行PCR擴增，共擴增出107條譜帶，其中多態(tài)性位點102個。對結(jié)果進行遺傳多樣性的分析，遺傳相似系數(shù)在0.40-0.65之間。聚類分析結(jié)果表明，能將65個白菜品種劃分為4大類，并表現(xiàn)出大部分種質(zhì)資源關(guān)系與其來源地有一定的相關(guān)性。張波[10]對不結(jié)球白菜晚抽薹分子標(biāo)記及抽萎性的遺傳多樣性進行了分析研究，研究表明，利用的RAPD、SSR，ISSR、SRAP多種分子標(biāo)記手段進行遺傳分析，最后僅從SSR引物中得到一條引物DBCl6與晚抽薹基因緊密連鎖，其遺傳距離為5.7cM，其余分子標(biāo)記方式則均未發(fā)現(xiàn)與晚抽薹基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。王笑一[11]等在用20對SSR引物建立80個小白菜品種的指紋圖譜的前提下，并對其進行了遺傳特異性分析，聚類分析表明，87.50% 的品種具有遺傳特異性。

3 SSR指紋圖譜的構(gòu)建和雜交種純度的鑒定

現(xiàn)階段我國對于白菜種質(zhì)資源主要通過農(nóng)藝性狀和形態(tài)表型進行鑒定的，由于鑒定周期較長，性狀差異不明顯，且受環(huán)境影響較大，從而難以將不同種質(zhì)資源完全區(qū)分開來。品種間無論從形態(tài)、生理和生化上的區(qū)別，其實都是DNA水平上的差異，所以運用分子標(biāo)記技術(shù)是通過直接分析遺傳多態(tài)性從DNA水平上來鑒定品種間差異。SSR由于具有高多態(tài)性和可重復(fù)性，是應(yīng)用于蔬菜作物類品種間鑒定及雜交種純度的鑒定較廣泛的分子標(biāo)記技術(shù)之一，李麗[1]等開發(fā)了由3個引物對組成的6套EST-SSR復(fù)合標(biāo)記組合，并完成了43個白菜品種的鑒別和大白菜品種差異的檢測，驗證了其EST-SSR復(fù)合標(biāo)記能代表白菜品種間的多態(tài)性、品種內(nèi)一致性、穩(wěn)定性和重復(fù)性，并且可以高效準(zhǔn)確的對白菜和大白菜品種的真實性和雜交純度進行鑒別。

白菜雜交種是由獨立的兩個自交系雜交組配形成的，這兩個自交系均可獨立地與其他許多自交系組配，對于有些優(yōu)良的自交系，其使用頻率極高，所以造成大量品種都是同父異母或同母異父，其品種間的特異性鑒定更加困難。相比傳統(tǒng)的品種鑒定技術(shù)，SSR分子指紋技術(shù)是對新品種審定和檢測品種唯一性、一致性及穩(wěn)定性的一種較有效的分子技術(shù)方法。雖然不能僅用其作為直接判定品種具有特異性的依據(jù)，但可以通過分子技術(shù)形成的品種SSR指紋圖譜數(shù)據(jù)信息篩查出與之近似的品種，然后將新申請的品種與近似品種田間并排種植，進行形態(tài)DUS測試，從而達到對新品種鑒定的目的。目前黃瓜、柑橘、玉米、小麥等作物已經(jīng)構(gòu)建了SSR指紋圖譜運用在品種鑒定方面。雖然目前白菜在構(gòu)建SSR指紋圖譜數(shù)據(jù)這方面鮮有報道，王笑一[11]等已經(jīng)從131對SSR引物中篩選了2O對多態(tài)引物組合，對80個品種進行了分析，利用其中5對引物Nal2E02、Nal2A08、Ni4D09、BRMS-269和BRMS-296的組合，可以將80個品種完全分開，從而構(gòu)建了SSR指紋圖譜。

4 遺傳圖譜構(gòu)建和分子標(biāo)記在輔助育種上的應(yīng)用

隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的快速發(fā)展，從以往的利用雜種優(yōu)勢進行白菜品種的選育到現(xiàn)在的以分子標(biāo)記作為白菜品種的一種有效的輔助育種手段[12]。其中SSR標(biāo)記多態(tài)性高、共顯性遺傳、穩(wěn)定和可重復(fù)性好，適合于對蔬菜作物進行遺傳圖譜的構(gòu)建、QTL定位和作為輔助育種的手段，單曉政[13]等運用ISSR、RAPD、SSR、sRAP等分子標(biāo)記來構(gòu)建不結(jié)球白菜分子遺傳連鎖圖譜，分析結(jié)果表明構(gòu)建的連鎖圖譜包含l1個連鎖群，由139個標(biāo)記組成，包括19個RAPD標(biāo)記、22個SSR標(biāo)記、4個ISSR標(biāo)記和94個SRAP標(biāo)記。另外，原玉香[14]等利用SRAP、SSR、AFLP、STS、ESTP和CAPS等多種分子標(biāo)記和形態(tài)標(biāo)記，以大白菜晚抽薹DH系Y177-12和早抽薹DH系Y195-93為親本建立的183個DH系為作圖群體構(gòu)建了大白菜遺傳圖譜，為不同圖譜的比較與整合及重要農(nóng)藝性狀的基因定位奠定基礎(chǔ)。張明科[15]等利用231個多態(tài)性標(biāo)記，以紫菜薹和結(jié)球白菜雜交的F2群體為材料，建立了包含163個標(biāo)記、11個連鎖群和4個片段的大白菜分子連鎖圖譜，其中包括117個RSAP標(biāo)記、38個SRAP標(biāo)記、5個SSR標(biāo)記和3個RAPD標(biāo)記。通過對圖譜的分析，該圖譜可有效的用于紫色等性狀的QTL定位分析。Yuefei Li[16]等，利用71個SSR標(biāo)記、145個SRAP標(biāo)記建立了黃芯白菜的分子鏈鎖圖譜，平均遺傳距離為3.8cm，分析結(jié)果顯示，有3個QTLs控制了白菜黃芯的性狀表現(xiàn)，40%發(fā)生了表型變異。

其中抗病育種是白菜育種者長期關(guān)注的問題之一，分子標(biāo)記技術(shù)在大白菜抗病育種中也進行了一定量的研究。彭海濤[17]等利用群體分離分析法（BSA法）和SSR標(biāo)記進行與不結(jié)球白菜抗蕪菁花葉病毒（TuMV）基因連鎖標(biāo)記的篩選。通過SSR引物篩選，得到54對在雙親間穩(wěn)定表現(xiàn)多態(tài)性的引物。其中1個與蕪菁花葉病毒抗病基因連鎖的SSR標(biāo)記Ra3E05，連鎖距離為8.7cm，根據(jù)測序結(jié)果重新設(shè)計引物，用F：群體對其驗證，帶型與原SSR標(biāo)記表現(xiàn)一致，可用于分子標(biāo)記輔助育種。

5 問題與展望

綜上所述，目前在遺傳多樣性的分析、品種真實性和純度的鑒定以及在育種方面的研究中，SSR分子標(biāo)記與其他分子標(biāo)記類型相比，以其獨特的優(yōu)勢在白菜的分子水平上的研究有著極大的應(yīng)用價值及潛力。但與棉花、水稻、玉米等作物在分子標(biāo)記方面的研究相比，都存在較大的差距，同時也具有較大的研究空間。在白菜需要審定和登記的新品種日益增多的情況下，對于其品種真實性及純度的鑒定上，SSR分子指紋技術(shù)具有重要的應(yīng)用前景?，F(xiàn)階段在這方面還鮮有報道，所以構(gòu)建白菜的指紋圖譜數(shù)據(jù)庫對于品種鑒定是一種重要的分子技術(shù)手段，并與原有的形態(tài)DUS測試系統(tǒng)是相融合的。在白菜分子標(biāo)記輔助育種方面，對白菜進行遺傳多樣性的分析和遺傳圖譜的構(gòu)建可以使育種者清楚的了解到種質(zhì)資源的遺傳背景，再根據(jù)其育種要求進行改造和創(chuàng)新，培育出品質(zhì)優(yōu)良、抗逆性顯著及抗病蟲害較強的新品種，是我國育種者當(dāng)前比較重要的工作。

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作者簡介：張婉（1986.4-），女，在讀碩士，研究方向：植物分子生物學(xué)。

李麗（1963.6-），女，碩士，職稱：高級農(nóng)藝師，研究方向：利用分子標(biāo)記進行雜交種純度及品種真實性鑒定。

通訊作者：李麗

*通訊作者：lili@nercv.org