寡核苷酸類藥物磷的定性定量分析

李保山??仲婕??朱德領(lǐng)??施明珠

[摘要]目的 用鉬酸銨比色紫外分光光度法測(cè)定抗肝癌藥物磷含量。 方法 用硝酸-高氯酸消解，鉬酸銨比色紫外分光光度法測(cè)定藥品中磷含量。用核磁共振31P-NMR譜，又進(jìn)一步確定了本品寡核苷酸類化合物磷酸骨架上化學(xué)位移為55 ppm的PS鍵。 結(jié)果 分光光度法磷含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.13X+0.0227，r=0.9995，方法的精密度分別為：0.74%，重現(xiàn)性5.6%，回收率99.65%。 結(jié)論 鉬酸銨比色紫外分光光度法測(cè)定寡核苷酸類抗肝癌藥物和抗病毒藥物中磷的含量，可操作性強(qiáng)，回收率較高，可為其他核酸類藥物測(cè)定提供借鑒。31P-NMR譜進(jìn)一步分析了P在硫代寡核苷酸藥物中磷的存在形式。

[關(guān)鍵詞]鉬酸銨紫外分光光度法；寡核苷酸；磷

[中圖分類號(hào)] O657.63 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2013）08-63-03

FLU和CT102為正在研制的硫代寡核苷酸類抗病毒藥物、抗癌藥物，均為含磷化合物，磷以磷氧鍵（PS）的形式存在?？偭琢渴且粋€(gè)固定的值，反映了寡核苷酸的純度，從寡核苷酸中測(cè)得了總磷量，就可知樣品中寡核苷酸的量，這就是用磷測(cè)核酸純度的理論依據(jù)，所以磷含量是本品原料藥的一個(gè)重要的質(zhì)量控制指標(biāo)，有必要準(zhǔn)確定量，精確控制質(zhì)量。

將有機(jī)磷酸化合物分解轉(zhuǎn)化成無機(jī)磷酸鹽的形式的方法一般有氧化分解法、磷鉬藍(lán)光度測(cè)定法[1-2]。氧化分解法操作雖簡(jiǎn)便但由于磷在高溫灼燒之后對(duì)鉑絲有腐蝕作用，使得鉑絲逐漸破損變脆會(huì)影響結(jié)果的測(cè)定，現(xiàn)已少用[3]。我們應(yīng)用現(xiàn)已有的儀器條件，將樣品先消解，制成水溶液，用紫外分光光度法測(cè)定了本品中總磷的含量[4]。用核磁共振31P-NMR譜，又進(jìn)一步確定了本品寡核苷酸類化合物磷酸骨架上化學(xué)位移為55ppm的PS鍵。

1 儀器與試藥

紫外可見分光光度計(jì)，UV-2450，日本島津公司。VARIAN INOVA 600 核磁共振儀，美國(guó)瓦里安公司。

磷酸根離子1000 mg/L，全國(guó)化工標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究開發(fā)中心，批號(hào)：GBW（E）080525，磷酸二氫鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉均為（優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限分司生產(chǎn)）；濃硝酸，高氯酸，鉬酸銨，對(duì)苯二酚，亞硫酸鈉，均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

超純水：18.2 MΩ/cm，Millipore公司試驗(yàn)用藥物：寡核苷酸抗流感新藥FLU，批號(hào)：20100512-1，20100706；寡核苷酸抗肝癌新藥CT102；批號(hào)：20120626，20120817-2，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所九室。

2 測(cè)試條件

2.1 總磷含量（比色UV-VIS法）

鉬酸銨溶液的制備：精密稱取2.5 g鉬酸銨，加30 mL水溶解，最后加37.5%的硫酸溶液20 mL，即得。

對(duì)苯二酚溶液的制備：精密稱取對(duì)苯二酚0.5 g，置100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，再加濃硫酸一滴，即得。如產(chǎn)生顏色變化，則重配。

亞硫酸鈉溶液的制備（20%）：精密稱取5.0 g亞硫酸鈉置25 mL容量瓶中溶解，即得（臨用前配制）。

顯色與測(cè)定：量取樣品溶液15 mL置25 mL容量瓶中，加2.5 mL鉬酸銨溶液，搖晃，放置30 s。再加對(duì)苯二酚溶液2.5 mL。再加2.5 mL 20%的亞硫酸鈉溶液。最后加水至刻度。放置30 min，在730 nm處測(cè)吸收值。

2.2 核磁共振31P-NMR譜

溶劑：D2O；溫度：環(huán)境溫度；程序：延遲 1.000 s，暫停 47.0 度，捕獲時(shí)間 0.266 s；掃描寬度：60060.1 Hz；掃描次數(shù)：30000 次。觀測(cè)： P31，242.7908595 MHz；減 弱 波：H1，599.7718912 MHz；電源：46 dB 在采集時(shí)打開；在延遲時(shí)關(guān)閉 WALTZ-16 modulated。自動(dòng)進(jìn)樣：15μg/mL。

3 結(jié)果與討論

3.1 對(duì)照品溶液的制備和線性

對(duì)照品溶液的配制：精密稱取0.1860 g磷酸二氫鉀，置1000 mL容量瓶中，加水至刻度。

標(biāo)準(zhǔn)磷溶液的制備：分別量取1、2.5、5、10、15 mL置25 mL容量瓶中，不足15 mL的加水補(bǔ)足。分別加2.5 mL鉬酸銨溶液，振搖，放置30 s。再分別加對(duì)苯二酚溶液2.5 mL，和20%的亞硫酸鈉溶2.5 mL液，加水至刻度，放置30 min。用水做隨行空白作為參比溶深夜，在730 nm處測(cè)其吸收值。以P濃度為橫坐標(biāo)，吸收值為綜坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=0.13X+0.0227，r=0.9995。

3.2 樣品前處理

取干燥至恒重的樣品43～44 mg，精密稱定（43.5 mg），加水溶解，置50 mL容量瓶中，加水至刻度。取此溶液10 mL于圓底燒瓶中，加水10 mL、玻璃珠數(shù)粒和濃硝酸2 mL，緩緩加熱濃縮至10 mL，冷卻。再加濃硝酸5 mL，用調(diào)溫電熱套加熱濃縮至10 mL，冷卻。再加5 mL高氯酸，用調(diào)溫電熱套加熱，待冒白煙后，于瓶口處放一漏斗，使其回流并回流濃縮直至溶液為3 mL，放置，待冷卻，定量轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用水沖洗燒瓶數(shù)次，加水至刻度，即得樣品溶液。

3.3 精密度試驗(yàn)

取磷酸二氫鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液（4.241 mg/L），按2.1項(xiàng)下方法顯色后，重復(fù)測(cè)定5次，RSD為0.74%。

3.4 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一批樣品（CT102，批號(hào)20120626），5份，按3.2項(xiàng)下樣品處理方法制得樣品貯備液，按2.3項(xiàng)下顯色并測(cè)定，樣品中磷分別為8.345%、8.982%、8.273%、7.666%、8.415%，平均含量為8.34%，RSD=5.6% 。

3.5 回收率測(cè)定

取干燥至恒重的樣品（CT102，批號(hào)20120626）43.5 mg，用水溶解，置50 mL容量瓶中，加水至刻度。分別取5 mL，7份，分別置于圓底燒瓶中，其中6份分別加入磷酸二氫鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液（C=0.186 mg/mL）2.0，2.0，2.5，2.5，3.0和3.0 mL，剩余一份不加標(biāo)液。然后各加水至20 mL，玻璃珠數(shù)粒，濃硝酸2 mL，用調(diào)溫電熱套加熱濃縮至10 mL，冷卻。再加濃硝酸5 mL，用調(diào)溫電熱套加熱濃縮至10 mL，冷卻。再加5 mL高氯酸，用調(diào)溫電熱套加熱，待冒白煙后，于瓶口處放一漏斗，使其回流并回流濃縮直至溶液為3 mL，放置，待冷卻，定量轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用水沖洗凈燒瓶數(shù)次，加水至刻度，即得回收率測(cè)定樣品溶液。從樣品溶液中各取10 mL置于25 mL容量瓶中，加2.5 mL鉬酸銨溶液，震蕩并放置30 s，再加2.5 mL對(duì)苯二酚溶液，最后加2.5 mL 20%的亞硫酸鈉溶液，空白為不加對(duì)照品母液其余相同的溶液，放置30 min。用紫外可見分光光度計(jì)于730 nm處測(cè)其吸收值，依標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算磷的量，測(cè)定回收率。回收率結(jié)果如表2。

3.6 核磁共振31P-NMR譜P S鍵

用核磁共振31P-NMR譜，確定本品寡核苷酸類化合物磷酸骨架上化學(xué)位移為55 ppm的PS鍵。

圖1 PS鍵核磁共振31P-NMR譜圖

4 結(jié)論

用硝酸-高氯酸消解，鉬酸銨比色紫外分光光度法測(cè)

定寡核苷酸類抗肝癌藥物和抗病毒藥物中磷的含量，簡(jiǎn)單易行，操作性強(qiáng)，結(jié)果穩(wěn)定性好，回收率較高，可為其他核酸類藥物測(cè)定提供借鑒。

本文鉬酸銨比色紫外分光光度法[4]測(cè)定該藥品中磷含量測(cè)定磷含量，兩批CT102中磷含量為8.345%（20120626）和8.22%（20120817-2）；兩批FLU中磷含量為8.89%（20100706）和8.982%（20100512-1）。

用核磁共振31P-NMR譜，確定了本品寡核苷酸類化合物磷酸骨架上化學(xué)位移為55 ppm的PS鍵。見圖1。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 劉德富.卵磷脂中磷的分光光度法測(cè)定[J].松遼學(xué)刊（自然科學(xué)版），1998，10 （4）：41.

[2] 馬金玲，張紅軍.分光光度法測(cè)定大豆磷脂中磷的含量[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2000，23（1）：21.

[3] 陳世彬，史亞軍，施俊輝，等.黃芩提取物亞微乳中磷含量的測(cè)定[J].成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，35（3）：70.

[4] 中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn).GB 11893-89水質(zhì)總磷的測(cè)定鉬酸銨分光光度法[S].1989.

（收稿日期：2013-03-25）