小鼠LIGHT胞外段基因原核表達載體的構建及其多克隆抗體的制備

徐莎等

【摘 要】目的：PCR擴增小鼠LIGHT胞外段基因（LIGHTECD），構建含LIGHTECD的原核表達載體，誘導表達重組蛋白，并免疫新西蘭兔，制備多克隆抗體。方法：提取小鼠骨髓來源的未成熟樹突狀細胞中的總mRNA，RT-PCR技術擴增LIGHTECD，克隆至原核表達質粒pGEX-6P-2中，構建重組表達載體pGEX-6P-2-LIGHTECD。重組質粒進行PCR和基因測序鑒定后，轉化大腸桿菌XL-1 Blue，IPTG誘導表達。融合蛋白純化后純化后免疫新西蘭兔，ELISA 及Western- blot 分析兔血清中抗LIGHTECD抗體的效價和特異性。結果：RT-PCR擴增得到525 bp LIGHTECD目的片段；經PCR和測序鑒定，證明構建的重組質粒中插入的片段為LIGHTECD基因，測序結果經BLAST分析，與Genbank上登錄序列完全一致；經IPTG誘導，重組質粒表達一相對分子量（Mr）約為45kD的目的蛋白條帶。ELISA 檢測免疫兔血清效價為1∶20 000。結論：成功地克隆了小鼠LIGHT胞外段基因，并表達了相應可溶性蛋白，準備了高效價的兔抗LIGHTECD多克隆抗體，為進一步研究其功能奠定了基礎。

【關鍵詞】LIGHT；原核表達；免疫原性；多克隆抗體

LIGHT （lymphotoxin-like inducible protein that competes with glycoprotein D for herpesvirus entry on T cells）最早是Mauri等[1]在對單純皰疹病毒入侵活化T細胞的研究中發(fā)現的，是腫瘤壞死因子超家族的第14個成員，又名HVEM-L （Herpesvirus entry mdeiator-Ligand）或TNFSF14，是一種非CD28依賴的協同刺激分子。LIGHT是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，多以三聚體形式表達于活化的T細胞、未成熟DC、單核細胞、脾細胞及粒細胞膜上，也可以分泌型形式存在[2]。目前已經證實TNFSF14可以與3 種膜結合型的TNF受體家族成員結合，即TNFRSF14、LTβR （ lymphotoxinβ receptor）和DcR3，啟動不同的生物學效應。現有研究已發(fā)現，TNFSF14信號通路通過刺激T細胞增殖、分化和誘導靶細胞凋亡，在抗腫瘤免疫、誘導自身免疫病和移植排斥反應、調節(jié)神經觸突的發(fā)育和脂代謝及抗感染免疫中發(fā)揮重要功能[3-9]。

LIGHT作為一個多功能多效應分子，具有共刺激和細胞毒等活性，克隆LIGHT基因并獲得其重組蛋白對研究該蛋白的生物學功能具有重要作用。而LIGHT胞外段基因（LIGHTECD）是其與相應受體結合，從而發(fā)揮作用的關鍵部位，因此本實驗擬克隆LIGHTECD，構建原核表達載體，表達可溶性蛋白，并制備多克隆抗體，為進一步研究其功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、質粒及主要試劑

4～6w雄性C57BL/6小鼠，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。E.coli XL-1 Blue及原核表達質粒pGEX-6p-2均由本研究所保存。rmIL-4（cat#404- ML）、rmGM-CSF（cat#415- ML） 購自R&D公司。DNA膠回收純化試劑盒、小量質粒提取試劑盒、限制性內切酶（BamHⅠ，NotⅠ）均購自TaKaRa公司。細胞總mRNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒購自Invitrogen公司

1.2 樹突狀細胞總mRNA的提取及cDNA的合成

收集小鼠骨髓來源的樹突狀細胞，體外用rmIL-4和rmGM-CSF刺激，誘導分化為未成熟樹突狀細胞。離心收集細胞，用細胞總mRNA提取試劑盒按說明書操作提取細胞總mRNA，紫外分光光度法測定其濃度和純度后保存。按RT-PCR試劑盒介紹的方法反轉錄成cDNA。

1.3 小鼠LIGHT胞外段基因的擴增

根據Pubmed數據庫小鼠LIGHT基因序列，對照pGEX-6p-2載體上的多克隆酶切位點，設計LIGHTECD的特異性擴增引物。上游引物為：5′-CGG▼GATCCATAGTAGCTCATCTGCCAGA-3′，下劃線序列為BamHⅠ酶切位點，下游引物為：5′-ATAAGAATGC▼GGCCGCTCAGACCATGAAAGCTCCG-3′，下劃線序列為NotⅠ酶切位點。以cDNA為模板，PCR擴增LIGHTECD。擴增條件為：預變性94℃ 3min后，進入變性94℃ 30s ，退火58℃ 30s，延伸72℃ 45s的循環(huán)，共計35次，末次循環(huán)后補延72℃ 10min，終止反應。經電泳鑒定后，用DNA膠回收純化試劑盒純化PCR產物。

1.4 小鼠LIGHT胞外段基因的克隆及鑒定

純化的LIGHTECD PCR擴增產物和pGEX-6p-2空質粒經BamHⅠ和NotⅠ雙酶切后，用T4 DNA Ligase 連接，轉化至E.coli XL-1 Blue感受態(tài)細胞中，用含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，篩選陽性克隆并用PCR初步鑒定。挑取PCR初篩陽性的單個菌落，接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，提取質粒送往北京賽諾基因組研究中心測序，序列正確的重組質粒命名為pGEX-6p-2-LIGHTECD。

1.5 小鼠LIGHT蛋白的誘導表達和SDS-PAGE分析

挑取經測序鑒定的陽性菌落到LB液體培養(yǎng)基（含有100 μg/ml 氨芐青霉素）中，37℃ 培養(yǎng)16～18h。按1∶100比例接種于400 ml 含100 μg/ml 氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)基中后，37℃ 培養(yǎng)至A600 nm達0.8。加入IPTG（終濃度為200 μmol/L），22℃ 振蕩培養(yǎng)5 h，同時設不加IPTG組作為對照。6000 r/min 離心收集細菌，將細菌沉淀重懸于20 ml 含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液中，超聲。4℃，15000 r/min 離心15 min，收集上清，分裝，保存于-80 ℃?zhèn)溆?。? ml上清液，加20 μl PBS 洗滌過的谷胱苷肽瓊脂糖珠4B，室溫旋轉孵育1 h，離心收集谷胱苷肽瓊脂糖珠， 用0.25% PBST洗滌2次，再用PBS洗滌1次后，得到純化的融合蛋白。經12% SDS-PAGE 凝膠電泳，Coomassie blue染色，鑒定融合蛋白的表達情況。

1.6 動物免疫

取100μL 融合蛋白，加入等體積弗氏完全佐劑，超聲充分乳化后，皮下多點注射免疫新西蘭大白兔。第一次免疫2w后，取100μL融合蛋白與等體積的弗氏不完全佐劑超聲乳化進行后，免疫第2次，間隔2w進行免疫第3次。同時設PBS免疫組為對照。免疫前及末次免疫后7d，心臟采血，分離兔血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 抗體效價測定

用間接ELISA法測定兔免疫血清中特異性抗體效價。用10μg/mL LIGHTECD抗原包被酶標板，每孔100μl，同時設GST蛋白和空白對照。4℃包被過夜，0.05%PBST 洗滌3 次后，用10%BSA 室溫封閉1 h，加入倍比稀釋的待測兔免疫血清，37℃溫育1 h，用0.05%PBST 洗滌3 次，分別加入HRP 標記的羊抗兔IgG，37℃溫育1 h，充分洗滌后，加入顯色劑ABTS，37℃避光溫育5～10min，用2mol/L H2SO4 終止反應，用酶標儀讀取405 nm波長處OD值。實驗組OD405 大于或等于GST 對照孔2倍以上判為陽性，以陽性者的血清最高稀釋度定義為抗體效價，即抗體滴度。

1.8 融合蛋白免疫反應性鑒定

將純化的LIGHTECD融合蛋白進行SDS- PAGE 電泳分離，轉移至硝酸纖維素膜，5%的脫脂奶粉封閉后，以免疫兔血清為一抗，HRP 標記的羊抗兔IgG為二抗，進行Western blot 分析，鑒定LIGHTECD融合蛋白的免疫反應性。

2 結果

2.1 LIGHTECD的PCR擴增

提取小鼠骨髓來源的樹突狀細胞總mRNA，經RT-PCR擴增后，1.2%的瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，擴增得到525 bp大小的目的DNA片段，大小與預期結果相符（圖1）。

2.2 重組質粒的構建及鑒定

重組質粒pGEX-6p-2-LIGHTECD用LIGHTECD特異性引物擴增得到525bp的目的片段，經序列測定，Blast軟件分析測序結果結果表明擴增的目的基因序列與GenBank上登錄號為GI：133892635的基因同源性為100%，且密碼子讀碼框架正確。

2.3 LIGHTECD的表達分析

將經測序鑒定的陽性重組質粒轉化至E.coli XL-1 Blue表達菌中，IPTG誘導表達后，提取菌體總蛋白，并經谷胱甘肽瓊脂糖珠4B純化后，進行SDS-PAGE分析。結果顯示，約在45kD處出現一特異性蛋白條帶，與預期目的蛋白大小一致，表明LIGHTECD在原核系統(tǒng)內得到表達（圖3）。

2.4 LIGHTECD融合蛋白免疫原性鑒定

用間接ELISA 法測定兔免疫血清中抗LIGHTECD特異性抗體產生水平。結果顯示：最高抗體滴度達1∶20 000，而PBS免疫對照組小鼠血清抗體未檢測出特異性的抗體，提示LIGHTECD融合蛋白可刺激新西蘭大白兔產生免疫反應，該蛋白具有很好的免疫原性。

2.5 LIGHTECD蛋白免疫反應性鑒定

用LIGHTECD兔免疫血清作一抗，HRP標記的羊抗兔IgG為二抗，進行Western-blot分析。結果顯示：純化的LIGHTECD重組蛋白在約45kDa 處出現陽性反應帶，而只表達GST的空質粒轉化表達純化產物未出現條帶，表明兔免疫血清能特異性識別LIGHTECD融合蛋白（圖3），該蛋白具有良好的免疫反應性。

3 討論

LIGHT是新發(fā)現的腫瘤壞死因子超家族的第14個成員，主要表達在激活的T淋巴細胞和未成熟DC（iDC）上，并具有刺激T淋巴細胞增殖，誘導iDC成熟，促進Thl型細胞因子產生的功能。ILGHT在不同組織和細胞中的選擇性表達，與其在免疫反應中的不同調節(jié)作用有關，通過與不同靶細胞上表達的受體結合，LIGHT可啟動不同的生物學效應。

本研究分離小鼠骨髓來源的樹突狀細胞，在其中加入IL-4和GM-CSF，誘導其分化為未成熟DC，以高表達LIGHT。GM-CSF可以誘導DC前體增殖分化，并在體外維持DC的活性，是維持DCs發(fā)育及分化最根本的細胞因子；IL-4則能抑制培養(yǎng)物中粒細胞和巨噬細胞的分化增殖，有利于DC分化并維持DCs于未成熟狀態(tài)。因此，實驗過程中常用IL-4和GM-CSF誘導分化未成熟DC。

LIGHT胞外段基因長525bp，編碼175個氨基酸。本文從小鼠樹突狀細胞上成功擴增得到LIGHT胞外段基因片段，與原核表達載體pGEX-6p-2連接，構建了pGEX-6p-2-LIGHTECD原核表達系統(tǒng)。將pGEX-6p-2-LIGHTECD重組質粒轉化到E.coli XL1 Blue，經IPTG誘導后表達出可溶性LIGHTECD融合蛋白。

使外源基因在原核細胞中高效表達的前提是選擇高效的表達載體和合適的工程。本研究選擇的pGEX-6p-2表達載體，是經pBR322質粒改造而來的一種原核表達載體，采用tac啟動子，tac啟動子是一種由lac啟動子（乳糖操縱子）和trp啟動子（色氨酸操縱子）人工構建的雜合啟動子，它是一種非常強的啟動子，可使mRNA轉錄水平提高，誘導外源基因在宿主菌中高效表達；而且它是一種誘導型啟動子，誘導型表達載體在沒有誘導物的情況下，外源基因不表達，宿主菌的生長不受目的蛋白的影響，當宿主菌生長到一定量時，加入誘導物IPTG，啟動目的蛋白的表達，由此可以獲得較高產量的目的蛋白。它含有GST的編碼序列，可使表達的外源重組蛋白融合入一個相對分子質量約為26 kD 的 GST純化標簽，該標簽對表達蛋白的有效純化和保持蛋白質的天然生物學活性作用重大。

除了所選擇的表達系統(tǒng)和表達菌種可影響目的蛋白的表達及其表達量外，誘導劑的濃度、誘導溫度和時間等也均可在一定程度上影響目的蛋白的表達。本文對重組蛋白的誘導表達條件進行了系列探索，結果顯示：誘導劑IPTG濃度為200μmol/L、在22℃誘導5h時蛋白表達量較高，并以可溶性形式表達。張亞麗[10]等也構建了LIGHT胞外段的原核表達載體，他們選擇的是pET-24a原核表達系統(tǒng)，表達的蛋白主要以包涵體形式存在。本文構建的pGEX-6p-2-LIGTHECD明顯優(yōu)于其構建的pET-24a-LIGTHECD原核表達重組體，利于目的蛋白的純化及功能研究。

用該重組蛋白免疫新西蘭兔制備免疫血清，ELISA測定特異性抗體滴度達1∶20 000，說明該蛋白具有較強的免疫原性。Western Blot 結果顯示該原核表達的融合蛋白能與相應的抗體特異性結合。

本研究成功構建了重組質粒pGEX-6p-2-LIGHTECD，并得到相應的可溶性蛋白和兔免疫血清，為下一步的功能研究奠定了基礎。

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