RGD對骨肉瘤細胞MG63的抑瘤作用

李杰等

【摘 要】目的：利用合成的RGD（ Arg-Gly-Asp） 三肽研究其對骨肉瘤細胞增殖抑制作用可能的機制。方法：不同濃度RGD作用于骨肉瘤細胞后，MTT法檢測骨肉瘤細胞增殖抑制率變化，流式細胞術(shù)檢測骨肉瘤細胞凋亡情況。結(jié)果：RGD能明顯呈濃度依賴性抑制骨肉瘤細胞的生長。RGD處理后，可以導(dǎo)致MG63骨肉瘤細胞的凋亡。結(jié)論：RGD能明顯抑制MG63骨肉瘤細胞生長，并促骨肉瘤細胞凋亡，這種作用具有明顯時間劑量效應(yīng)。

【關(guān)鍵詞】RGD； 骨肉瘤； 凋亡；

骨肉瘤是一種臨床常見惡性骨腫瘤，約占所有骨腫瘤的20%。其惡性程度高，好發(fā)于青少年，易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差[1]。目前臨床上主要采用外科手術(shù)和化療聯(lián)合治療，新輔助化療的應(yīng)用使骨肉瘤患者的生存率較以前有了很大的提高[2]。傳統(tǒng)的化療藥物主要是通過細胞毒性藥物殺滅腫瘤，其對機體嚴重的毒副作用和腫瘤產(chǎn)生的耐藥性使繼續(xù)有效的化療陷入了困境。這都成為了目前困擾骨肉瘤治療的主要問題。因此，尋找作用機制與現(xiàn)有化療藥物不同，且特異性高、毒副作用小的抗腫瘤靶向藥物成為了腫瘤基礎(chǔ)和臨床的研究熱點。RGD 肽是一類含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp） 序列的短肽，廣泛存在于生物體內(nèi)，是整合素（ Integrin） 與其配體蛋白相互作用的識別位點。自Pierschbacher 等于1984年首次報道纖維蛋白原中所含的RGD 序列為細胞識別位點以來，RGD 肽及其衍生物就成為眾多學(xué)者關(guān)注與研究的熱點。通過本實驗我們發(fā)現(xiàn)，RGD可以抑制骨肉瘤細胞增殖并促進骨肉瘤細胞凋亡作用。

1 材料及方法

1.1 試劑 RGD 三肽及人骨肉瘤細胞MG63由本實驗室保存。細胞培養(yǎng)用DMEM 培養(yǎng)基含10%胎牛血清和1%的青、鏈霉素，購自杭州四季青生物工程材料有限公司，無噬菌體，低內(nèi)毒素，培養(yǎng)條件為5%的CO2及37 ℃。MTT及凋亡試劑盒均購自Sigma公司。

1.3 細胞傳代及培養(yǎng) 骨肉瘤細胞在5%CO2和37℃的條件下，在含10%～15%小牛血清的1640培養(yǎng)基（ Invitrogen）中貼壁生長。細胞用含0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA的消化液消化進行傳代。加入0.5～1ml 0.25%胰酶溶液，一般室溫消化時間約為1～3分鐘。用吸管將貼壁的細胞吹打成懸液，分到另外兩到三瓶中，實踐培養(yǎng)液塞好橡皮塞，置37℃下繼續(xù)培養(yǎng)。第二天觀察貼壁生長情況。

1.3 實驗分組 本實驗共分為4組，RGD 25μg/ml組，RGD 50μg/ml組，RGD 75μg/ml組及空白對照組。

1.4 MTT檢測細胞增殖 將處于對數(shù)生長期的骨肉瘤細胞于轉(zhuǎn)染后的第24h、48h加入MTT20μl/孔（5mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4h后吸棄上清。加入二甲亞砜150μl/孔，溶解甲瓚紫結(jié)晶，酶標(biāo)儀570nm波長下測定吸光度A值，每孔設(shè)3個復(fù)孔取均值，計算抑制率。相對抑制率=（1-轉(zhuǎn)染組/ 對照組）×100﹪。

1.5 細胞凋亡實驗 取對數(shù)生長期細胞胰酶消化、細胞計數(shù)，以5*105/瓶細胞數(shù)轉(zhuǎn)至6孔板培養(yǎng)16h，加無血清培養(yǎng)基同步化12h，進行加藥處理。分別給藥作用24h和48h后，胰酶消化，離心收集細胞，用冷PBS 洗滌兩次，加入100μL 1X annexin-binding buffer溶解，按照凋亡檢測試劑盒操作依次加入檢測試劑 。流式檢測細胞凋亡 。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 121 0 軟件包處理數(shù)據(jù)， 采用單因素方差分析， 以P< 0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義， 實驗數(shù)據(jù)均重復(fù)測定3 次以上。

2 實驗結(jié)果

2.1 MTT結(jié)果呈現(xiàn)濃度依賴性抑制MG63骨肉瘤細胞增殖，RGD 對MG63 細胞的增殖抑制如表1所示。結(jié)果顯示，RGD 能明顯抑制MG63 細胞增殖，并且這種抑制作用呈濃度依賴性增強。

2.2 RGD誘導(dǎo)MG63 骨肉瘤細胞凋亡：RGD誘導(dǎo)MG63 細胞凋亡結(jié)果如圖1，圖2所示。流式細胞檢測顯示，RGD能明顯促進MG63細胞凋亡，并且這種凋亡作用呈濃度依賴性增強。

3 討論

RGD 肽作為整合素和其配體相互作用的識別位點，能與腫瘤細胞或者新生血管特異表達的某些整合素如αvβ3結(jié)合[3]， 眾所周知，腫瘤血管的生成或新生血管的萌芽在腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移中起到重要作用。研究表明，沒有形成新生血管來提供氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的，腫瘤的生長不會增長。而一旦血管化，以前處于休眠狀態(tài)的腫瘤便開始迅速增長，侵入周圍組織，并發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移。既然癌細胞能夠高效的侵襲和轉(zhuǎn)移，那么之前細胞外基質(zhì)的降解則是其入侵前必需的。整合素作為一類細胞黏附受體分子，則廣泛參與細胞與細胞外基質(zhì)、細胞與細胞之間的相互作用[4]。雖然內(nèi)皮細胞能夠表達許多種不同的整合素，但是αvβ3 在血管生成中是最重要的[5]。在激活的內(nèi)皮細胞、新生血管以及某些腫瘤細胞常特異性地高表達整合素αvβ3，而在處于休眠狀態(tài)的內(nèi)皮細胞和正常的器官系統(tǒng)則不表達，使腫瘤血管靶向治療成為可能[6]。 研究表明整合素αvβ3 在骨肉瘤實體腫瘤細胞表面有高水平的表達，而在正常骨細胞未見表達，在其他實體腫瘤表面少量表達[7]。而且骨肉瘤易通過血管肺部轉(zhuǎn)移，Ham等人[8]利用RGD與整合素αvβ3結(jié)合研究表明攜帶RGD的相關(guān)病毒靜脈用藥骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移的小鼠，結(jié)果提示，通過RGD的介入明顯抑制了骨肉瘤肺部轉(zhuǎn)移瘤的生長，認為RGD在骨肉瘤血管靶向治療上發(fā)揮重要作用。相信RGD肽修飾后的相關(guān)給藥系統(tǒng)以及病毒載體在高表達整合素αvβ3骨肉瘤治療上以及抑制骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移上應(yīng)該有很好的應(yīng)用前景。

在本實驗中，通過MTT檢測我們觀察到各實驗組對骨肉瘤細胞增殖的抑制作用均明顯高于對照組，且隨時間推移，抑制率增加。通過細胞凋亡實驗檢測，各實驗組對骨肉瘤細胞的凋亡作用均明顯高于對照組，且隨時間推移，凋亡率增加。結(jié)果顯示，RGD可以抑制骨肉瘤細胞增殖并促進骨肉瘤細胞凋亡作用。

參考文獻：

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