芥藍(lán)離體再生體系的優(yōu)化

范愛麗　黃志鵬等

摘要：以芥藍(lán)（Brassica oleracea）真葉和子葉段為外植體，研究了TDZ濃度、基因型及苗齡等因素對(duì)芥藍(lán)不定芽再生的影響。結(jié)果表明，真葉和子葉段的最佳不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基分別為MS+0.50～1.00 mg/L TDZ和MS+0.50 mg/L TDZ，真葉和子葉段再生頻率分別達(dá)到82.56%和89.06%。最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.10 mg/L NAA，其生根率達(dá)到100.00%，再生植株移栽成活率為96.00%。

關(guān)鍵詞：芥藍(lán)（Brassica oleracea）；TDZ；真葉；子葉段；離體再生

中圖分類號(hào)：S635.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）09-2171-03

芥藍(lán)（Brassica oleracea）是起源于中國(guó)南方的一種特產(chǎn)蔬菜[1]，性喜冷涼，秋播冬收，主要食用花薹或嫩株，質(zhì)脆可口，營(yíng)養(yǎng)豐富且具有抗癌保健功效[2]。近年來全球氣候變暖，高溫脅迫導(dǎo)致芥藍(lán)品質(zhì)劣化、商品率降低。隨著現(xiàn)代育種技術(shù)手段不斷發(fā)展，通過離體誘變或基因工程方法可快速選育出芥藍(lán)耐熱種質(zhì)或品種，提高芥藍(lán)品質(zhì)與產(chǎn)量。芥藍(lán)組織培養(yǎng)是離體誘變和轉(zhuǎn)基因的基礎(chǔ)，芥藍(lán)離體再生的外植體有莖段[3-5]、腋芽[6]、下胚軸[7-11]、子葉[12]和帶柄子葉[13]。唐君等[11]將下胚軸經(jīng)苯基噻二唑脲（TDZ）[14]浸泡預(yù)處理，而在培養(yǎng)基中添加高效誘芽激素TDZ對(duì)芥藍(lán)真葉離體再生的影響尚未報(bào)道。

本研究探討了TDZ濃度、基因型及苗齡等因素對(duì)芥藍(lán)不定芽再生的影響，進(jìn)一步優(yōu)化芥藍(lán)離體再生體系，旨在建立對(duì)芥藍(lán)具有較廣泛適應(yīng)性的離體再生體系，為芥藍(lán)無性系離體誘變和轉(zhuǎn)基因進(jìn)行育種工作提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

以黃花大筍芥藍(lán)（J1）、正源大筍黃花芥藍(lán)（J2）及自主雜交的F1芥藍(lán)（J3）種子為試驗(yàn)材料。

1.2 方法

1.2.1 無菌苗的培養(yǎng) 挑選子粒飽滿的芥藍(lán)種子，在超凈工作臺(tái)上先用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇表面殺菌約1 min，再用10% NaClO溶液滅菌20～25 min，然后用無菌水反復(fù)沖洗4～5次，最后將種子平放于MS固體培養(yǎng)基表面（MS培養(yǎng)基均添加0.7%瓊脂，3%蔗糖，pH 5.8，121 ℃滅菌20 min）。每瓶約10～15粒，放置于光照培養(yǎng)箱，培養(yǎng)溫度（25±1） ℃，光照時(shí)間16 h/d，光照強(qiáng)度2 000 μmol/（m2·s），獲得的無菌苗供切割外植體用。

1.2.3 不同基因型及苗齡對(duì)芥藍(lán)外植體不定芽再生的影響 在最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，觀察比較不同基因型芥藍(lán)外植體J1、J2、J3不定芽的再生頻率和再生系數(shù)，培養(yǎng)方法同上；在最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基中分別接種最優(yōu)基因型芥藍(lán)的不同苗齡（4、5、6、7、8、9、10、11、12、13 d）外植體，培養(yǎng)方法同上。

1.2.4 不同濃度NAA對(duì)芥藍(lán)外植體不定芽生根的影響 不定芽長(zhǎng)到2～3 cm時(shí)，轉(zhuǎn)入含有不同濃度NAA（0.00、0.10、0.30和0.50 mg/L）的1/2 MS生根培養(yǎng)基中，20 d后對(duì)生根效果進(jìn)行觀察對(duì)比，篩選出最適濃度。待基部形成大量的毛根后，打開三角瓶口，煉苗6～7 d后取出小苗，洗凈根部培養(yǎng)基后移栽到自配基質(zhì)中，30 d后統(tǒng)計(jì)成活率，再定植于大田。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度TDZ對(duì)芥藍(lán)外植體不定芽再生的影響結(jié)果

2.2 不同基因型對(duì)芥藍(lán)外植體不定芽再生的影響結(jié)果

在含0.50 mg/L TDZ的培養(yǎng)基中，不同基因型外植體不定芽的再生頻率和再生系數(shù)見表2。由表2可見，J1子葉段的再生頻率最低（73.49%），J2子葉段的再生頻率最高（89.06%）；子葉段再生系數(shù)最高的是J3（3.63）。J2和J3真葉的再生頻率間無顯著差異，但兩者與J1均有顯著差異（P<0.05）；J2真葉再生系數(shù)最高（2.91），與J1有顯著差異（P<0.05）。綜合比較3種基因型外植體的再生頻率和再生系數(shù)，J2（正源大筍黃花芥藍(lán)）為不定芽誘導(dǎo)的最優(yōu)基因型。

2.3 不同苗齡對(duì)芥藍(lán)外植體不定芽再生的影響結(jié)果

2.4 不同濃度NAA對(duì)芥藍(lán)外植體不定芽生根的影響結(jié)果

3 小結(jié)與討論

本研究結(jié)果表明，TDZ既可以促進(jìn)生根、又可促進(jìn)形成愈傷組織，也可以直接再生不定芽，且濃度在0.05～1.00 mg/L范圍內(nèi)真葉有較好的再生效果。當(dāng)TDZ濃度為0.50 mg/L，J2子葉段和真葉最高再生頻率分別為89.06%和82.56%，與唐君等[11]下胚軸經(jīng)0.50 mg/L TDZ浸泡30 min，放置于6-BA和NAA的激素組合的最高再生頻率為98.50%，相差不到10.00%，滿足后續(xù)試驗(yàn)的要求。本研究采用單一激素TDZ誘導(dǎo)芥藍(lán)不定芽，試驗(yàn)適宜濃度范圍廣且易于操作，相對(duì)于前人研究方法簡(jiǎn)單，再生頻率較高，再生芽數(shù)多，為芥藍(lán)無性系離體誘變和轉(zhuǎn)基因進(jìn)行育種工作提供了一定的參考。

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